SDS-PAGE (dodecil sulfat de sodiu-poliacrilamidă electroforeză în gel) este frecvent utilizat în laborator pentru separarea proteinelor pe baza greutății lor moleculare. Este una dintre acele tehnici care este frecvent utilizat, dar nu frecvent pe deplin înțeles. Așa că hai să încercăm să rezolvăm asta.SDS-PAGE separă proteinele în funcție de greutatea lor moleculară, pe baza ratelor lor diferențiale de migrare printr-o matrice de cernere (un gel) sub influența unui câmp electric aplicat.,mișcarea oricărei specii încărcate printr-un câmp electric este determinată de sarcina sa netă, de raza sa moleculară și de magnitudinea câmpului aplicat. Dar problema cu proteinele pliate nativ este că nici sarcina lor netă, nici raza lor moleculară nu depind de greutatea moleculară. În schimb, sarcina lor netă este determinată de compoziția aminoacizilor, adică suma aminoacizilor pozitivi și negativi din proteină și raza moleculară prin structura terțiară a proteinei.,deci, în starea lor nativă, diferite proteine cu aceeași greutate moleculară ar migra la viteze diferite într-un câmp electric, în funcție de sarcina lor și de forma 3D.pentru a separa proteinele într-un câmp electric numai pe baza greutății lor moleculare, trebuie să distrugem structura terțiară prin reducerea proteinei la o moleculă liniară și să maschăm cumva sarcina netă intrinsecă a proteinei. Aici intervine SDS.,
rolul SDS (et al)
SDS este un detergent care este prezent în tamponul de probă SDS-PAGE unde, împreună cu un pic de fierbere și un agent reducător (în mod normal DTT sau B-ME pentru a descompune legăturile disulfidice proteină-proteină), perturbă structura terțiară a proteinelor. Acest lucru aduce proteinele pliate până la molecule liniare.SDS acoperă, de asemenea, proteina cu o sarcină negativă uniformă, care maschează sarcinile intrinseci pe grupurile R. SDS se leagă destul de uniform la proteinele liniare (în jurul valorii de 1.,4G SDS / 1g protein), ceea ce înseamnă că încărcarea proteinei este acum aproximativ proporțională cu greutatea sa moleculară.
SDS este, de asemenea, prezent în gel pentru a asigurați-vă că, odată ce proteinele sunt liniarizate și taxe mascate, vor ramane asa pe tot parcursul rula.
factorul dominant în determinarea unei proteine acoperite cu SDS este raza moleculară a acesteia., Proteinele acoperite cu SDS s-au dovedit a fi molecule liniare, 18 angstromi lățime și cu lungime proporțională cu greutatea lor moleculară, astfel încât raza moleculară (și, prin urmare, mobilitatea lor în gel) este determinată de greutatea moleculară a proteinei. Deoarece proteinele acoperite cu SDS au același raport de încărcare / masă, nu va exista o migrare diferențială bazată pe Încărcare.
matricea de Gel
într-un câmp electric aplicat, proteinele tratate cu SDS se vor deplasa acum spre anodul pozitiv la rate diferite, în funcție de greutatea lor moleculară., Aceste mobilități diferite vor fi exagerate datorită mediului de frecare ridicat al unei matrice de gel.după cum sugerează și numele, matricea de gel utilizată pentru SDS-PAGE este poliacrilamida, care este o alegere bună deoarece este inertă din punct de vedere chimic și, esențial, poate fi ușor alcătuită la o varietate concentrații pentru a produce diferite dimensiuni ale porilor, oferind o varietate de condiții de separare care pot fi modificate în funcție de nevoile dvs. Poate vă amintiți că am scris anterior un articol despre mecanismul polimerizării acrilamidei.,
sistemul tampon discontinuu și gelul de stivuire-căptușirea lor la linia de pornire
pentru a conduce curentul de la catod (negativ) la anod (pozitiv) prin gel, este evident necesar un tampon. În mare parte folosim sistemul tampon discontinuu laemmli. „Discontinuu” înseamnă pur și simplu că tamponul din gel și rezervor este diferit.de obicei, sistemul este configurat cu un gel de stivuire la pH 6,8, tamponat de Tris-HCl, un gel de rulare tamponat la pH 8,8 de Tris-HCl și un tampon de electrod la pH 8,3., Gelul de stivuire are o concentrație scăzută de acrilamidă, iar gelul de rulare o concentrație mai mare capabilă să întârzie mișcarea proteinelor.
Deci, ce e cu toate aceste diferite pH-lui?ei bine, Glicina poate exista în trei stări de încărcare diferite, pozitive, neutre sau negative, în funcție de pH. acest lucru este prezentat în diagrama de mai jos. Controlul stării de încărcare a glicinei de către diferitele tampoane este cheia întregului lucru de stivuire a gelului.,
deci, iată cum funcționează gelul de stivuire. Când alimentarea este pornită, ionii de glicină încărcați negativ în tamponul electrodului pH 8,3 sunt forțați să intre în gelul de stivuire, unde pH-ul este de 6,8. În acest mediu, glicina trece predominant la starea zwitterionică (încărcată neutru). Această pierdere de sarcină îi determină să se miște foarte încet în câmpul electric.
ionii Cl (din Tris – HCl) pe de altă parte, se mișcă mult mai repede în câmpul electric și formează un front de ioni care migrează înaintea glicinei., Separarea Cl-de contra-ion Tris (care se deplasează acum spre anod) creează o zonă îngustă cu un gradient de tensiune abruptă care trage glicina de – a lungul în spatele ei, rezultând două fronturi înguste separate de ioni migratori; Frontul Cl-extrem de mobil, urmat de Frontul glicinei mai lent, mai ales neutru.,toate proteinele din proba de gel au o mobilitate electroforetică care este intermediară între extrema mobilității glicinei și Cl -, astfel încât atunci când cele două fronturi străbat bine eșantionul, proteinele sunt concentrate în zona îngustă dintre fronturile Cl-și glicină.
și sunt oprite!această procesiune continuă până când atinge gelul de rulare, unde pH-ul trece la 8,8. La acest pH, moleculele de glicină sunt în mare parte încărcate negativ și pot migra mult mai repede decât proteinele., Deci Frontul glicinei accelerează dincolo de proteine, lăsându-le în praf.rezultatul este că proteinele sunt aruncate într-o bandă foarte îngustă la interfața gelurilor de stivuire și rulare și deoarece gelul de rulare are o concentrație crescută de acrilamidă, ceea ce încetinește mișcarea proteinelor în funcție de mărimea lor, începe separarea.
despre ce a fost vorba?dacă încă vă întrebați de ce este nevoie de gelul de stivuire, gândiți-vă ce s-ar întâmpla dacă nu ați folosi unul.,puțurile de Gel au o adâncime de aproximativ 1 cm și, în general, trebuie să le umpleți substanțial pentru a obține suficientă proteină pe gel. Deci, în absența unui gel de stivuire, eșantionul dvs. ar sta deasupra gelului de rulare, ca o bandă de până la 1 cm adâncime.
în loc să fie aliniate împreună și să lovească gelul de alergare împreună, acest lucru ar însemna că proteinele din proba dvs. ar intra toate în gelul de alergare la momente diferite, rezultând benzi foarte murdare.,deci, gelul de stivuire asigură că toate proteinele ajung la gelul de rulare în același timp, astfel încât proteinele cu aceeași greutate moleculară vor migra ca benzi strânse.odată ce proteinele sunt în gelul de rulare, ele sunt separate, deoarece proteinele cu greutate moleculară mai mare se mișcă mai lent prin gelul acrilamidă poroasă decât proteinele cu greutate moleculară mai mică. Dimensiunea porilor din gel poate fi modificată în funcție de mărimea proteinelor pe care doriți să le separați prin schimbarea concentrației de acrilamidă. Valorile tipice sunt prezentate mai jos.,
Pentru o mai largă gama de separare, sau pentru proteine, care sunt greu de separat, un gradient gel, care are straturi de creșterea concentrația de acrilamidă, poate fi folosit.