electroforeza în gel ADN este o tehnică utilizată pentru separarea și identificarea fragmentelor de ADN în funcție de dimensiune.fragmentele de ADN de diferite dimensiuni sunt încărcate într – un gel poros obținut din agaroză-un carbohidrat găsit în algele roșii.când se aplică un câmp electric, fragmentele vor migra prin gel, datorită grupărilor fosfatice încărcate negativ în nucleotidele ADN. piesele mai mici de ADN vor migra mai ușor prin gel decât fragmentele mai mari, care au un timp mai dificil de mișcare prin matricea de gel.,
când rularea gelului este completă, localizarea probelor ADN poate fi comparată cu o serie de fragmente sau benzi de dimensiuni cunoscute, numite scară ADN.prezența fragmentului dvs. de interes poate fi apoi confirmată pe baza dimensiunii sale, care este determinată prin compararea locației relative a eșantionului dvs. de testare cu fragmentele scării.gelurile de agaroză sunt preparate folosind o soluție procentuală de greutate peste volum. Deci, 1 gram de agaroză în 100 ml de tampon va face un gel de 1%., Gelurile cu procent mai mic vor rezolva mai bine fragmentele mai mari, iar gelurile cu procent mai mare vor face fragmentele mai mici mai ușor de identificat. Pentru a începe procedura de fabricare a gelului, cântăriți masa corespunzătoare de agaroză într-un balon Erlenmeyer.
adăugați tampon de funcționare în balon, astfel încât volumul tamponului să nu fie mai mare de 1/3 din capacitatea balonului. Apoi rotiți pentru a amesteca.se topește amestecul de agaroză / tampon prin încălzirea într-un cuptor cu microunde la putere maximă. La fiecare treizeci de secunde, scoateți balonul și rotiți conținutul pentru a se amesteca bine. Repetați până când agaroza s-a dizolvat complet.,apoi adăugați bromură de etidiu la o concentrație de 0,5 mg/ml. Bromura de etidiu este un compus aromatic care se potrivește între perechile individuale de baze de ADN sau intercalați și determină ca ADN-ul să emită fluorescență portocalie intensă sub lumină UV. Este important să rețineți că bromura de etidiu este cancerigenă, astfel încât mănușile trebuie purtate întotdeauna la manipularea gelurilor care conțin acest compus.pentru a preveni deformarea tăvii de gel, lăsați agaroza să se răcească plasându-l într-o baie de apă de 65ºc.pe măsură ce agaroza se răcește, pregătiți forma de gel prin plasarea tăvii de gel în aparatul de turnare., Ca alternativă, puteți utiliza banda pentru a sigila marginile deschise ale tăvii de gel pentru a crea matrița. Plasarea unui pieptene în gel creează puțurile în care este încărcat ADN-ul. Asigurați-vă că pieptenele va crea un puț care să aibă dimensiunea potrivită pentru proba dvs. de ADN.se toarnă agaroza topită în forma de gel și se lasă să se întărească la temperatura camerei.după ce agaroza s-a întărit, scoateți pieptenele. Dacă gelul nu va fi utilizat imediat, înfășurați-l în folie de plastic și păstrați-l la 4ºC până la utilizare. dacă gelul va fi utilizat imediat, puneți-l în cutia de gel.,pentru a începe această procedură, adăugați colorant de încărcare a gelului la probele de ADN care urmează să fie separate. Încărcarea colorantului se face de obicei la o concentrație de 6x. Încărcarea colorantului ajută la vizualizarea și încărcarea probelor în puțuri și ajută la determinarea cât de departe au migrat probele în timpul rulării.
setați sursa de alimentare la tensiunea dorită. Acum adăugați suficient tampon de rulare în cutia de gel pentru a acoperi suprafața gelului. Asigurați-vă că utilizați același tampon de funcționare ca cel utilizat pentru prepararea gelului.conectați cablurile cutiei de gel la sursa de alimentare și porniți-o., Amintiți-vă că ADN-ul este încărcat negativ și se va deplasa spre anod, care este pozitiv și, în general, de culoare roșie. Asigurați-vă că nu conectați plumbul negru sau catodul la partea inferioară a cutiei de gel. Deci, nu uitați, rețineți că pisicile negre sunt ghinion sau negative, iar catodul negru este, prin urmare, negativ. Rulați gelul în roșu sau anodul. Pentru a verifica dacă atât cutia de gel, cât și sursa de alimentare funcționează; apariția bulelor la electrozi indică faptul că trece curentul. scoateți capacul cutiei de gel., Încărcați încet și cu atenție probele de ADN în gel. Din nou, colorantul de încărcare din eșantion permite eșantionului să se scufunde în gel și va ajuta la urmărirea cât de departe a parcurs eșantionul. Un marker de dimensiune ADN, sau scara, ar trebui să fie întotdeauna încărcate împreună cu probele experimentale.
înlocuiți capacul. Verificați de două ori dacă electrozii sunt conectați la sloturile corecte din sursa de alimentare.
porniți alimentarea. Rulați gelul până când colorantul a migrat la o distanță corespunzătoare.când electroforeza este completă, opriți sursa de alimentare și scoateți capacul cutiei de gel.,scoateți gelul din cutia de gel și scurgeți excesul de tampon de pe suprafața gelului. Așezați tava cu gel pe prosoape de hârtie pentru a absorbi orice tampon rămas.pentru a vizualiza fragmentele de ADN, scoateți gelul din tava de gel și expuneți gelul la lumină ultra violetă. fragmentul de ADN ar trebui să apară sub formă de benzi fluorescente portocalii. Faceți o fotografie a gelului.la sfârșitul experimentului, aruncați în mod corespunzător gelul și tamponul de funcționare pe reglementările instituției. Din nou, nu uitați să manipulați întotdeauna gelul și tampoanele de rulare cu mănuși pentru a evita expunerea la bromură de etidiu.,acum ,că ați văzut cum să efectuați electroforeza în gel ADN. Să aruncăm o privire la unele aplicații în aval și variații ale acestei metode extrem de utile. aici vedeți un rezultat de electroforeză în gel de agaroză după separarea produselor PCR. Fragmentele de ADN încărcate în gel sunt vizibile ca benzi clar definite. Standardul sau scara ADN trebuie separate într-o măsură care să permită determinarea utilă a dimensiunilor benzilor de probă. În acest exemplu, fragmente de ADN de 765 perechi de baze, 880 perechi de baze și 1022 perechi de baze sunt separate pe a 1.,5% gel de agaroză cu o scară ADN cu 2 jurnale.pe lângă confirmarea prezenței unui fragment de ADN de interes, electroforeza în gel ADN poate fi combinată cu procedurile de purificare a gelului. De obicei, o lamă de ras este folosită pentru a tăia fragmentul de ADN de interes, astfel încât să poată fi colectat și proba de ADN din interiorul acestuia recuperată.,
gel de Agaroză electrophesis poate fi, de asemenea, combinate cu transfer de sugativă, care implică permițându-ADN sau ARN, pentru a transfera la o membrană de celuloză unde radioactive sonde pot fi folosite pentru a identifica anumite secvențe de ADN sau ARN-ului în electrophoretically-a separat de probă.electroforeza în gel ADN standard nu este ideală pentru separarea ADN-ului cu greutate moleculară mare mai mare de 15-20 kb, cum ar fi ADN-ul genomic. Pentru a separa probele mari de ADN, se utilizează electroforeza în gel cu câmp pulsatoriu, care implică supunerea gelului la un câmp electric în schimbare sau pulsatoriu în direcții diferite., Această tehnică implică un aparat specializat de funcționare a gelului, care are perechi de electrozi îmbrăcați în orientări diferite în jurul gelului. Acest lucru poate fi folosit pentru a detecta diferențele de dimensiuni ale genomului între populațiile de organisme, cum ar fi probele de ADN adunate din diferite comunități microbiene, vedeți aici, care sunt prelevate din diferite medii ale lacurilor.
tocmai ați văzut o introducere în electroforeza în gel ADN., V-am arătat conceptul din spatele metodei, cum să preparați gelul de agaroză, cum să încărcați probele, cum să rulați gelul și să îl analizați și câteva aplicații comune ale electroforezei în gel de agaroză. Vă mulțumim pentru vizionarea și noroc cu rularea gel.