O introducere în ARN-seq

secvențierea ARN (Wang 2009) înlocuiește rapid microarrays Expresie genică în multe laboratoare. ARN-seq vă permite să cuantificați, să descoperiți și să profilați ARN-urile. Pentru această tehnică, ARNm (și alte ARNr) sunt mai întâi convertite în ADNc. ADNc este apoi utilizat ca intrare pentru o pregătire de bibliotecă secvențiere de generație următoare. În acest articol, voi da o scurtă trecere în revistă a ARN-seq și să introducă metodele majore utilizate astăzi.

de ce ARN-Seq este „mai bun” decât Microarrays?,

există mai multe avantaje pe care ARN-seq le are față de microarrays:

cu ARN-SEQ puteți interoga mai mult decât expresia genelor diferențiale. Deși există microarrays disponibile pentru analiza la nivel de exon și microRNA, cei mai mulți utilizatori sunt încă interesați de bază, probabil 3′ părtinitoare, expresia genelor diferențiale. Cu ARN-seq vă puteți uita la codificarea și non-codarea ARN, la îmbinarea și exprimarea specifică a alelelor și, eventual, în curând la secvențele cDNA de lungime întreagă, eliminând necesitatea de a deduce sau asambla izoforme.,

Microarrays sunt, de asemenea, părtinitoare, deoarece trebuie să decidem ce conținut să plasăm pe matrice. Deoarece ARN-seq nu utilizează sonde sau primeri, datele suferă de prejudecăți mult mai mici (deși nu vreau să spun că ARN-seq nu are niciunul).

ARN-seq furnizează date digitale sub formă de numărătoare de citire aliniate, rezultând o gamă dinamică foarte largă, îmbunătățind sensibilitatea detectării pentru transcrieri rare.de asemenea, este foarte competitiv din punct de vedere al costurilor pentru microarrays, deoarece astăzi, între probele 6-30 pot fi multiplexate într-o singură bandă de secvențiere Illumina.,

în cele din urmă, puteți reanaliza un set de date ARN-seq pe măsură ce devin disponibile mai multe informații despre transcriptom. Dacă este publicată o lucrare care arată o variantă interesantă de îmbinare într-un sistem similar cu cel pe care lucrați, atunci ați putea dori să vă întoarceți și să vă uitați la acea îmbinare în eșantioanele dvs.; și ați avea deja datele pentru a face acest lucru.

cum funcționează ARN-Seq?

există multe metode pentru efectuarea unui experiment ARN-seq. De fapt, tehnicile evoluează atât de rapid încât poate fi dificil să se decidă care dintre ele să fie utilizate., O alegere de bază este între 1) sinteza ADNc amorsată aleator din ADNc dublu catenar sau 2) metode de ligare a ARN-ului (revizuite și comparate în Levin 2010). Majoritatea oamenilor folosesc prima metodă și apoi trebuie să facă o alegere suplimentară între un protocol specific componentelor și unul care nu este. Metoda folosită cel mai mult în laboratorul meu este ARN-ul Truseq al Illumina, care este un protocol non-strand specific pentru sinteza ADNc amorsată aleator.odată ce aveți o bibliotecă de secvențiere, aceasta este secvențiată la o adâncime specificată, care depinde de ceea ce doriți să faceți cu datele., Aceste citiri sunt aliniate la genom sau transcriptom și sunt numărate pentru a determina expresia genelor diferențiale sau analizate în continuare pentru a determina îmbinarea și expresia izoformelor. Majoritatea oamenilor secvențiază ARN folosind metode 50-100bp cu capăt pereche. Excepția este secvențierea microRNA, deoarece aceasta necesită doar secvențierea 36bp unică în majoritatea cazurilor.

metoda noastră ARN-Seq

folosim între 100 ng și 1 µg de ARN total ca intrare la o captare a ARNm cu margele magnetice acoperite cu oligo-DT. ARNm este fragmentat și apoi se efectuează o sinteză ADNc amorsată aleator., Rezultat dublu-strand adnc este utilizată ca intrare pentru un standard Illuminati biblioteca de pregatire, care include end-ghid de reparații, adaptor ligatura și amplificarea PCR a oferi o bibliotecă gata pentru secvențiere.

De ce deranjez cu informații Strand?

au existat multe discuții despre transcrierea anti-sens și relevanța sa biologică. Dacă sunteți interesat de expresia genelor diferențiale simple, atunci informațiile despre strand nu vor adăuga mult experimentului dvs., dar vă vor face protocolul mai complex., Acestea fiind spuse, puteți efectua metoda cea mai larg adoptată fără prea mult efort suplimentar. Pentru aceasta, în timpul sintezei ADNc al doilea fir, utilizați uracil pentru încorporare în loc de timină. Urmați pregătirea Bibliotecii Illumina în mod normal, dar după legarea adaptorului și înainte de amplificarea PCR adăugați uracil-ADN glicozilază pentru a degrada a 2-A linie. Acest lucru duce la toate citirile începând cu aceeași orientare, astfel încât să puteți determina ce fir a fost transcris în eșantionul dvs.

ce puteți face de fapt cu ARN-Seq?,

ARN-seq este un instrument puternic și versatil publicat pe scară largă în ultimii ani. Am ales câteva dintre preferatele mele (unele din lucrările efectuate în instalația de bază pe care o gestionez) pentru a ilustra ce puteți face cu secvențierea ARN.jabbari și colab. folosit ARN-seq pentru a investiga psoriazisul și pentru a găsi noi gene pentru analiza funcțională. Ei au comparat datele ARN-seq cu studiile array publicate și au găsit 1700 de noi candidați. Acestea au fost validate de qPCR, iar comparația cu bazele de date funcționale pentru Psoriazis a susținut rolul lor în patogeneză.

Kutter, și colab., s-a folosit ARN-seq într-un studiu care a analizat conservarea legării ARN polimerazei III la mamifere pentru a valida expresia genelor ocupate de Pol III, așa cum au fost testate prin ChIP-seq.Mercer și colab. ARN-seq combinat și captare pe bază de microarray pentru a identifica și caracteriza transcrieri rare, care sunt în mod normal nedetectabile. Transcrierile vizate au crescut în abundență de citire secvențială de la 0.21% pre-captare la 80% post captare., Ei au descoperit mai mult de 200 de izoforme neanotate anterior pentru aproape 50 de loci care codifică proteinele, inclusiv o nouă izoformă alternativă a TP53, care este o genă foarte bine caracterizată. Acest lucru sugerează că există încă multă complexitate în genom și transcriptom care trebuie rezolvată.

în rezumat, ARN-seq este încă un instrument în evoluție, dar este de preferat în majoritatea cazurilor microarrays. Este mai sensibil, mai robust și poate fi mai rentabil. Ce proiecte ARN-seq planificați acum pentru proiectul dvs.?,jabbari și colab: profilarea transcripțională a psoriazisului folosind ARN-seq dezvăluie gene exprimate diferențial neidentificate anterior. Jurnalul de Dermatologie investigativă 2011.Kutter și colab: legarea Pol III la șase mamifere Arată conservarea în rândul izotipurilor de aminoacizi, în ciuda divergenței dintre genele Tarn. Nature Genetics 2011.Levin și colab: analiză comparativă cuprinzătoare a metodelor de secvențiere ARN specifice strandului. Metode De Natură 2010.Mercer et al: secvențierea ARN țintită dezvăluie complexitatea profundă a transcriptomului uman. Biotehnologia Naturii 2012.,Wang și colab.: ARN-Seq: un instrument revoluționar pentru transcriptomică. Nat Rev Genet 2009.

publicat inițial pe 25 mai 2012. Actualizat și revizuit la 16 August 2015.