Specificitate și Eficiență a ADN-Uracil Glycosylase Mediate Strand Clivaj Intervievati pe Mare Secvență Biblioteci

UDG mediate de uracil excizia și chimice AP-ul de clivaj pe microarrays

ADN clivaj mediată de UDG este format din două etape separate: excizia uracil de bază, urmată de clivaj rezultat abasic site-ul. Cele două etape pot fi monitorizate separat pe microarrays ADN., În primul rând, abasic site-uri sunt generate de tratarea matrice cu UDG și într-un al doilea pas, strand decolteul este indus prin expunerea de suprafață legați, oligonucleotide ADN care conțin abasic site-uri să fie acid sau condiții de bază, sau prin evaporarea la suprafata la uscare. Astfel de strategii chimice de scindare a siturilor abasice pe catenele ADN elimină necesitatea unei scindări enzimatice suplimentare și permit studierea independentă a cineticii UDG., Pentru acest scop, tablouri de 30mer secvențe de ADN cu un număr tot mai mare de non-consecutive dU-înmatriculări (ua1 – dU9) au fost concepute și sintetizate de maskless de acid nucleic fotolitografie, utilizarea corespunzătoare fotosensibil dU phosphoramidite (Fig. 2). Fiecare catenă ADN-ul a fost sintetizat cu un dT15-linker pentru suprafața de sticlă și încheiată la 5′-end cu un 25mer secvență țintă pentru hibridizare (QC25), după cum este indicat în Fig. 3.,

localizarea tuturor sonda secvențe împreună cu corespunzătoare reproduce și de a controla firele contabilă dT în loc de dU nucleotide a fost randomizat peste microarray suprafață., Înainte de a enzimatice prelucrare, sondă de ADN secvențe au fost hibridizate cu Cy3-etichetate complementare 25mer oligonucleotid (QC25c), în scopul de a determina inițială intensitatea fluorescenței valori. Etichetarea 3 ‘ – Cy3 a fost utilizată pentru a preveni posibilele artefacte de fluorescență datorate interacțiunilor colorantului cu numărul variabil de dUs46. Microarrays au fost apoi expuse la UDG din surse comerciale de E. coli și scindarea site-ului abasic a fost ulterior efectuată în diferite condiții. Timpul optim de expunere a enzimei a fost determinat în experimentele inițiale. Rezultatele noastre (Fig., S1) arată că, după adăugarea enzimei, eficiența de clivaj crește semnificativ cu timpul, până la o oră, atingând o eficiență de aproximativ 50-60%, cu doar ușoare modificări la expunerea ulterioară la UDG. Astfel, am stabilit timpul optim de expunere la o oră. În plus, datele noastre arată în mod clar creșterea eficienței de scindare cu un număr tot mai mare de dU, de la 40 la 60% (Fig. 3C și S1).

am trecut apoi la studiul etapei de clivaj propriu-zisă, îndepărtarea situsului abazic după excizia bazei de uracil., Următoarele cunoscute strategii pentru indusă chimic abasic site-ul de clivaj în solution20,30, rezulta ca AP-urile au fost apoi clivat fie în condiții alcaline prin cufundarea tablouri într-un 1:1 (v/v) soluție de etilendiamină(EDA)/etanol, sau tablouri au fost tratați în condiții acide prin cufundarea într-un 30% (v/v) soluție de acid tricloracetic în diclormetan, sau prin evaporarea la suprafața de matrice la uscare. În toate metodele, tratamentele au fost efectuate pentru diferite perioade de timp, variind de la 1 la 24 de ore., Ulterior, tablouri au fost rehybridized la Cy3-etichetate complementare 25mer oligonucleotid (QC25c) și rezultă intensitățile fluorescenței au fost comparate cu cele obținute înainte de UDG tratament, în scopul de a determina scindarea eficiență. Ratele de scindare rezultate sunt indicate în Fig. 4.

în condiții de bază (Fig. 4B), scindarea siturilor AP necesită o perioadă de incubație minimă de 2 ore pentru a observa scindarea semnificativă (40 până la 60%) a substraturilor. Cu toate acestea, tratarea matricei cu un acid sau uscarea suprafeței sale (Fig., 4A, respectiv C) are ca rezultat o scindare clară și extinsă după numai o oră (30 până la aproape 80% cu un tratament acid), când scindarea abazică mediată de AEA este minimă după o oră. Este probabil ca reacția de scindare în sine în metodele A și C să fie promovată în stadiul final de hibridizare, fie datorită temperaturii, fie prezenței unei amine în tampon., Cu toate acestea, din moment ce hibridizare este comună pentru toate cele trei metode, diferențele mari în decolteul cinetica între bază și non-tratamente de bază aluzie la posibilitatea ca suplimentare AP-uri pot fi produse în prezența unui acid, sau sub presiune redusă, obținându-se posturi suplimentare asupra ADN-ului la care un text clivaj reacția poate avea loc. Tratamentele mai lungi, indiferent de metodă, nu modifică semnificativ gradul de scindare, de obicei apropiindu-se de 40% până la 80% în funcție de numărul de încorporări dU., Într-adevăr, observăm o creștere generală clară a eficienței clivajului, cu un număr tot mai mare de încorporări, în toate condițiile testate.

În plus față de efectuarea clivajului catenei ADN induse chimic pe locațiile site-ului abasic, a fost examinată calitatea suprafeței microarray. Pentru acest scop, uniformitatea de caracteristici pe matrice suprafețe fost inspectată vizual bazat pe fluorescență intensități și pierderea de fluorescență pentru non-cleavable de control componente a fost monitorizat., Am constatat că abasic site-ul de clivaj în condiții alcaline permis specifice, enzime mediate scindarea dU-conțin secvențe dar a lăsat de control secvențe practic neatins, întrucât în condiții acide, ADN clivaj a fost observat, de asemenea, pentru a controla firele lipsit de uracil nucleotide (Fig. S2). Uscarea suprafeței a dus, de asemenea, la degradarea firelor de control numai dT. Deoarece numai scindarea site-ului abasic în condiții alcaline evită degradarea suprafeței și pierderea nespecifică a ADN-ului, am efectuat toate experimentele ulterioare în aceste condiții., Acest lucru asigură faptul că secvențele de control care nu pot fi scindate rămân disponibile pentru comparație chiar și după un tratament chimic lung.deoarece rezultatele noastre privind scindarea du mediată de E. coli UDG au furnizat doar eficiențe moderate de scindare pentru șuvițele de ADN care conțin încorporări dU unice (≈40%), am interogat specificitatea secvenței UDG pentru a identifica potențial un substrat care conține dU foarte scindat. În acest scop, am proiectat o bibliotecă de acizi nucleici care conține dU din secvențe de ADN dublu și monocatenar., Biblioteca constă dintr-o secvență permutabilă 7mer cu un singur dU în mijloc (Fig. 5). Permutarea regiunilor de flancare 3-nt, 5′ – precum și 3 ‘ din dU rezultă în secvențe unice 4096. În formatul dublu-catenar, s-au adăugat o buclă și secvența complementară la 7mer, ceea ce a dus la formarea unei structuri de ac de păr. Perechile de baze DG·dC suplimentare din tija acului au ajutat la creșterea temperaturii de topire a structurii ADN a acului. Aceste perechi de baze au fost adăugate la substraturile monocatenare pentru a menține modelele ssDNA și dsDNA cât mai similare posibil., În cele din urmă, o oligonucleotidă 25mer a fost adăugată la sfârșitul 5’al fiecărui design pentru a servi drept țintă de hibridizare. O figură reprezentativă a desenelor de secvență este prezentată în Fig. 5.

Deși terminal de etichetare a ADN-ului cu o vopsea fluorescentă este o metodă convenabilă pentru a măsura intensitatea fluorescenței, are dezavantajul de mare fluorescență de zgomot care, mai ales pe înaltă densitate microarrays, face extragerea datelor și interpretarea mai dificil. Prin urmare, am decis să monitorizăm reacția de clivaj prin hibridizare la secvențele imobilizate., Înainte de tratamentul cu UDG, single – și ADN dublu catenar substraturi au fost hibridizate la etichetate complementare 25mer oligonucleotid și scanate pentru a obține inițială a fluorescenței. Apoi, microarrays au fost expuse la UDG pentru diferite perioade de timp. După următoarea scindare a sitului AP în condiții alcaline, matricele au fost din nou hibridizate la complementele lor marcate cu Cy3. Scăderea semnalului de fluorescență al catenelor ADN în raport cu valorile fluorescenței pre-tratament corespunde direct eficienței de scindare., Eficiența maximă de scindare de aproximativ 40% a fost obținută pentru substraturile dublu catenare după incubarea UDG timp de 2 minute și rate de scindare ușor mai mici pentru substraturile monocatenare (tabelul S1). Această rată mai mică de singur-stranded contrazice studiile anterioare indică faptul că acestea sunt scindate mai repede decât dublu catenar equivalents13,47,48. Interesant este că incubațiile enzimatice foarte scurte (<1 min) duc încă la o eficiență semnificativă de scindare (30-35%)., Aceste puncte de timp scurte sunt deosebit de interesante, deoarece oferă indicii CLARE despre preferințele potențiale ale secvenței. Pentru a identifica dependența de secvență în degradarea ADN mediată de UDG din setul nostru de 4096 de fire individuale, ne-am concentrat pe 1% (Fig. 6)precum și 5% (Fig. S3) dintre cele mai multe și mai puțin scindate subset de secvențe. Motivele secvente reprezentative generate de aceste subseturi de secvente sunt prezentate în Fig. 6 și în informațiile suplimentare.,

pentru ADN dublu catenar (Fig. 6A, B), rezultatele arată o preferință clară a secvenței UDG pentru regiunile bogate în G/C care flancează uracilul. În schimb, UDG pare să proceseze slab substraturile dublu catenare care conțin perechi de baze T·A. Motivele extrase din substraturi UDG mai bune și mai sărace sunt în concordanță parțială cu datele din literatura de specialitate existente foarte limitate48,49,50. Seibert și colab., s-a emis ipoteza că eficiența UDG E. coli este legată de costul energetic al îndoirii și distorsiunii ADN care apar în procesul de recunoaștere a daunelor specifice. În simulări de dinamică moleculară și fluorescentei experimente cu două uracil-conțin ADN dublu catenar secvențe, au identificat că eficient forța de îndoire constantele sunt mai mici dacă dAs sau dTs sunt situate adiacent la uracil de nucleotide, în loc de direcții generale și dCs; sugerează că dA/dT bogate în secvențe ar putea fi mai ușor îndoit de UDG și, astfel, mai bine processed49., De singur-stranded ADN-ul este mult mai flexibilă formă de ADN, sa o procesare mai rapidă a raportat în literatura de specialitate ar putea fi din cauza mai mici costul energetic al scindarea substraturilor care sunt în mod inerent mai flexibil decât dsDNA7,47,49,51. Îndoire nu poate, totuși, să fie un factor decisiv în UDG clivaj specificitatea ssDNA, cu enzima recunoaște și despicat toate substraturile la fel de bine, ceea ce explică, poate, lipsa de secvență consens în dU-conțin ssDNA., Cu toate acestea, s-a emis ipoteza că efectele contextului secvenței se extind încă la ADN-ul monocatenar și, într-adevăr, au fost observate pentru UDG din virusul herpes simplex tip 152, dar rămâne încă neclar pentru UDG uman sau E. coli. Slupphaug și colab. a măsurat specificitatea secvenței UDG umane în 34 de contexte de secvență dsDNA și a presupus că dT 3′ to dU duce întotdeauna la îndepărtarea lentă, așa cum a făcut, oarecum discordant, un conținut ridicat de GC50. Eftedal și colab. a evaluat eficiența scindării atât a timusului de vițel, cât și A E. coli UDG din secvențele 41 dsDNA și a găsit un model similar., Cu setul nostru mult mai mare de secvențe, putem fi de acord că dT 3′ to dU duce întotdeauna la îndepărtarea lentă, dar datele noastre arată clar că dC, și dG într-o măsură mai mică, 3′ to dU duce la îndepărtarea rapidă. Nu am reușit să identificăm dependența de secvență semnificativă pentru excizia dU pe ssDNA (Fig. 6C, D). Trebuie remarcat faptul că dependența de secvență în substraturile dsDNA este clară pentru tratamentele enzimatice scurte (5s, 30s, 60s și 120s), dar se estompează încet pentru o expunere UDG mai lungă (30min), indicând faptul că toate substraturile sunt în cele din urmă scindate atunci când sunt expuse la enzimă.,

Clivaj site-ul optimizări

Deoarece nu semnificative secvență de dependență pentru UDG mediate de uracil excizia de pe single-stranded ADN-ul a apărut din studiile noastre și destul de moderată clivaj eficiență pentru un singur dU înmatriculări au fost obținute, am ales să studieze UDG-mediat dU excizia mai mult singur-stranded substraturi care conțin diferite forme de mai multe dU înmatriculări, cu scopul de identificare a unui anumit clivaj site-uri care sunt ușor enzimatic accesibile și să permită rapid și eficient strand clivaj., Motivul nostru este că creșterea distanței sondei de la suprafață ar trebui să ofere o mai mare accesibilitate pentru clivaj, dar acest efect nu poate fi transferat la distanțiere lungi (>20-nt)53. Pe baza rezultatelor din Fig. 3, Ne așteptăm, de asemenea, un număr mai mare de încorporări dU să conducă la o scindare generală mai mare, dar ne întrebăm dacă există o densitate optimă a nucleotidelor dU în secțiunea scindabilă a firului ADN. Prin urmare, am investigat scindarea uracilului la homopolimerii dU mai lungi (10, 15 și 20mers), precum și la oligomerii cu compoziție dU variabilă., Procentul de dU cadrul oligomer a fost calculată în raport cu celelalte patru nucleotide (dA, dC, dG și dT) și experimental realizat prin efectuarea unor reacții de cuplare cu pre-soluții mixte de dU/dA/dC/dG/dT phosphoramidites în diferite raporturi (0:100, 12:88, 25:75, 50:50 sau 100:0, (v/v) dU:dA/dC/dG/dT). Secvențele, construit pe poli-dT linkeri de diferite lungimi (dT1, dT5, dT10 și dT15), și dU-conțin regiune au fost apoi încheie cu un 25mer secvență țintă pentru a fi cultivat în scopuri cum este indicat în Fig. 7.,

După sinteză, 25mer fost hibridizat sale complementare 5′-Cy3 etichetate marcat și microarray a fost expus la UDG timp de 1 oră., Apoi, scindarea sitului abasic a fost efectuată în condiții alcaline, urmată de o rehybridizare finală. În paralel, am efectuat și testul de scindare cu enzima utilizator, care în acest caz elimină necesitatea unei proceduri suplimentare de scindare a site-ului abasic.

pentru testul enzimatic cu UDG urmat de scindarea abazică a locului în condiții alcaline (Fig. 7, stânga), am înregistrat eficiențe de scindare variind de la 4% până la 80% și cu tendințe clare în curs de dezvoltare., De exemplu, decolteul eficiența crește semnificativ cu creșterea lungimii dU-conțin regiune, în scopul de 10mer > 15mer > 20mer, cu un maxim de ~50% clivaj accesibil pentru un 10mer dU regiune, și maxim 80% pentru 20mer dU regiune. În mod similar, linkerii mai lungi au ca rezultat o rată generală de scindare mai mare. Aceste observații indică faptul că mai secvențe sunt mai bine recunoscute și corespunzătoare uracil baze mai bine excizate de UDG, care, la rândul său, sugerează o mai mare accesibilitate a mai substraturi de enzima., Eficiența scindării este, de asemenea, afectată de cantitatea de dU nucleotide din partea scindabilă a substratului. Într-adevăr, homopolimerii de uracil (100% dU) sunt aproape întotdeauna mai puțin scindați decât congenerii lor cu nucleotide dU intercalate, iar acest efect este deosebit de clar atunci când substraturile sunt sintetizate pe un linker T1 scurt. Pe de altă parte, creșterea conținutului dU de la 12 la 50% este satisfăcută cu creșterea eficienței de scindare, cu 50% dU care pare a fi suma optimă., Astfel, în condițiile noastre experimentale, scindarea mediată de UDG a fost cea mai eficientă pe cele mai lungi substraturi unde jumătate din nucleotidele din partea scindabilă sunt dU (eficiență de scindare 80%). Această tendință, precum și datele prezentate în Fig. 3, sugerează că UDG poate recunoaște și se leagă de mai multe încorporări dU, atâta timp cât dUs sunt separate prin nucleotide ADN canonice.

Timp scurt de homopolimeri sunt, în general, cunoscut ca fiind săraci UDG substraturi, avem, de asemenea, de așteptat pentru a observa un mic decolteu prețurile pentru 20mer cleavable regiuni, deoarece aceste substraturi sunt puțin probabil să fi găsit în ADN., In vivo, uracil baze apar mai ales în a ADN-ului din cauza misincorporation în timpul replicării sau din cauza deamination8,9 și ambele procese sunt puțin probabil să apară la un astfel de înaltă frecvență, pentru a forma homopolimeri. Cu toate acestea, moderată până la mare clivaj eficiență de aproximativ 60% pe timp 20mer dU homopolimeri au fost obținute, dar dacă aceste homopolimeri sunt procesate mai lent decât substraturi cu mici %dU conținutul rămâne să fie investigate.

tratarea unei biblioteci matrice ADN similare cu sistemul enzimatic utilizator (Fig., 7, dreapta) duce la scindarea satisfăcătoare a substraturilor monocatenare, cu tendințe de scindare oarecum comparabile cu cazul UDG, dar cu câteva excepții notabile. În primul rând, cea mai mare clivaj eficiența este mai mică decât pentru UDG/EDA sistem (55% versus 80%, respectiv), care pot fi atribuite la un ritm mai lent de prelucrare a abasic site-uri cu Endonucleaze VIII, comparativ cu o bază comună de tratament cu EDA., În al doilea rând, pare a fi un slab lungime discriminare în cleavable regiune, comparativ cu UDG/EDA, cu doar 20-25% diferență dintre cele mai scurte (10-nt) și lungi (20-nt) dU-conțin regiuni, atunci când UDG singur tratament a condus la variații mari în scindarea eficiența același 10 și 20mers (până la 50% diferenta). Din nou, acest efect s-ar putea datora diferențelor în rata de procesare a site-urilor AP. În cele din urmă, du homopolimerii par a fi degradați în aceeași măsură, indiferent de lungimea linker-ului sau a substratului., Această lipsă de discriminare în cazul enzimei utilizatorului și în comparație cu datele de scindare mediate de UDG sugerează că existența unor situsuri AP multiple, consecutive, este factorul limitativ în eliminarea enzimatică a situsurilor AP.pentru a rezuma, în mâinile noastre, am constatat că cele mai bune eficiențe de clivaj pot fi obținute cu clivajul mediat de UDG, urmat de tratamentul EDA pe substraturi mai lungi, non-homopolimerice care conțin uracil. În acest sens, secvențele monocatenare care conțin 50% dU pot fi scindate eficient, deși în două etape., Un scurt, un singur pas, tratamentul cu UTILIZATORUL enzimei de cocktail poate, de asemenea, convenabil despica până la 50% de dU-conțin un singur fire într-o oră, cu toate acestea, se pare că mai mici discriminatorii putere de special acest tratament enzimatic poate fi mai puțin utilă atunci când preferențial de clivaj este necesar.