UDG-vermittelte Uracil-Exzision und chemische AP-Site-Spaltung auf Mikroarrays
Die durch UDG vermittelte DNA-Strangspaltung besteht aus zwei getrennten Schritten: Exzision der Uracil-Base, gefolgt von Spaltung der Uracil-DNA-DNA-die resultierende abasische Seite. Die beiden Schritte können separat auf DNA-Mikroarrays überwacht werden., Zunächst werden abasische Stellen erzeugt, indem das Array mit UDG behandelt wird, und in einem zweiten Schritt wird die Strangspaltung induziert, indem die an der Oberfläche angebundenen DNA-Oligonukleotide, die abasische Stellen enthalten, entweder sauren oder basischen Bedingungen ausgesetzt werden, oder durch Verdampfen der Oberfläche zur Trockenheit. Solche chemischen Strategien zur Spaltung abasischer Stellen an DNA-Strängen eliminieren die Notwendigkeit einer zusätzlichen enzymatischen Spaltung und ermöglichen eine unabhängige Untersuchung der UDG-Kinetik., Zu diesem Zweck wurden Arrays von 30mer-DNA-Sequenzen mit einer zunehmenden Anzahl nicht aufeinanderfolgender dU-Integrationen (dU1 – dU9) durch maskenlose Nukleinsäurefotolithographie unter Verwendung des entsprechenden lichtempfindlichen dU-Phosphoramidits entworfen und synthetisiert (Abb. 2). Jeder DNA-Strang wurde mit einem dT15-Linker an der Glasoberfläche synthetisiert und am 5′-Ende mit einer 25mer-Zielsequenz zur Hybridisierung (QC25) beendet, wie in Fig. 3.,
Molecular structure of the 5′-NPPOC deoxyuridine 3′-phosphoramidite (in the text referred to as dU or uracil nucleotide.
(A) Sequence design for the investigation of uracil and abasic site cleavage on microarrays., Jede Sequenz besteht aus einem dT15-Linker, dann einem 30mer ohne dUs (Control) oder einer zunehmenden Anzahl von dU-Integrationen (von 1 bis 9), die dTs in der folgenden Reihenfolge ersetzen: 5′-TTA CCA TAG AAT CAT GTG CCA TAC ATC ATC-3′. Am 5′ – Ende wird ein Control 25mer synthetisiert (QC25), der als Ziel für die Hybridisierung zu seinem 3′-Cy3-markierten komplementären Oligonukleotid (QC25c) dient. Der Spaltungsprozess wurde durch Aufzeichnung der hybridisierungsbasierten Fluoreszenzintensität vor und nach der UDG-vermittelten Spaltung von Uracil-Nukleotiden überwacht. (B) Kleiner Auszug (ca., 7% der total Synthese-Bereich) der Fluoreszenz-scans vor und nach der Enzym-Exposition. Die Scans zeigen die Fluoreszenzintensität, resultierend aus der Hybridisierung zu einem markierten, komplementären Oligonukleotid. Die Mikroarrays wurden mit 5 µm Auflösung abgetastet. (C) Abnahme der Fluoreszenzintensität für die UDG-vermittelte Uracil-Exzision (wodurch abasische Stellen erzeugt werden) in Abhängigkeit von der Anzahl der dU-Nukleotid-Integrationen pro DNA-Substrat. Die tatsächlichen Spaltwirkungsgrade korrelieren mit dem Verlust der Fluoreszenzintensität, der aus der DNA-Substratspaltung resultiert., Das Array wurde für eine Stunde mit UDG inkubiert und die erzeugten abasischen Stellen wurden anschließend unter alkalischen Bedingungen gespalten. Die Abnahme der Fluoreszenzintensität wurde aufgezeichnet und auf den Kontrollstrang (U0) normalisiert. Die in willkürlichen Einheiten angegebenen normalisierten Intensitäten wurden über die Anzahl der dUs pro DNA-Substrat aufgetragen. Fehlerbalken sind SD.
Die Position aller Sondensequenzen zusammen mit entsprechenden Replikaten und Kontrollsträngen, die dT anstelle von dU-Nukleotiden tragen, wurde über die Mikroarrayoberfläche randomisiert., Vor der enzymatischen Verarbeitung wurden die DNA-Sondensequenzen mit dem Cy3-markierten komplementären 25mer-Oligonukleotid (QC25c) hybridisiert, um anfängliche Fluoreszenzintensitätswerte zu bestimmen. Die 3′-Cy3-Kennzeichnung wurde verwendet, um mögliche Fluoreszenzartefakte aufgrund von Wechselwirkungen des Farbstoffs mit der variablen Anzahl von dUs46 zu verhindern. Die Mikroarrays wurden dann kommerziell gewonnenem UDG von E. coli ausgesetzt und die abasische Spaltung der Stelle wurde anschließend unter verschiedenen Bedingungen durchgeführt. Die optimale Enzymexpositionszeit wurde in ersten Experimenten bestimmt. Unsere Ergebnisse (Abb., S1) zeigen, dass nach Zugabe des Enzyms die Spaltungseffizienz mit der Zeit bis zu einer Stunde signifikant ansteigt und einen Wirkungsgrad von etwa 50-60% erreicht, wobei sich bei weiterer Exposition gegenüber UDG nur geringfügige Änderungen ergeben. So stellen wir die optimale Belichtungszeit auf eine Stunde ein. Darüber hinaus zeigen unsere Daten deutlich eine erhöhte Spalteffizienz mit einer zunehmenden Anzahl von dU von 40 auf 60% (Abb. 3C und S1).
Anschließend untersuchten wir den eigentlichen Spaltschritt, die Entfernung der abasischen Stelle nach Exzision der Uracil-Basis., Nach bekannten Strategien zur chemisch induzierten Abasic Site Cleavage in solution20,30 wurden die resultierenden AP-Sites dann entweder unter alkalischen Bedingungen durch Eintauchen der Arrays in eine 1:1 (v/v) Lösung von Ethylendiamin(EDA)/Ethanol gespalten oder die Arrays wurden unter sauren Bedingungen behandelt, indem sie in eine 30% ige (v/v) Lösung von Trichloressigsäure in Dichlormethan eingetaucht wurden oder durch Verdampfen der Oberfläche des Arrays zu Trockenheit. In allen Methoden, die Behandlungen durchgeführt wurden, die für verschiedene Zeiträume, im Bereich von 1 bis 24 Stunden., Anschließend wurden die Arrays zu dem Cy3-markierten komplementären 25mer-Oligonukleotid (QC25c) rehybridisiert und die resultierenden Fluoreszenzintensitäten mit denen verglichen, die vor der UDG-Behandlung erhalten wurden, um die Spalteffizienz zu bestimmen. Die resultierenden Spaltraten sind in Abb. 4.
Abnahme der Fluoreszenz-Intensität nach der chemisch-induzierten abasic site Spaltung auf Substraten mit unterschiedlicher Anzahl von dU Eingemeindungen und als Funktion der Zeit., Die tatsächlichen Spaltwirkungsgrade korrelieren mit dem Verlust der Fluoreszenzintensität, der sich aus der DNA-Substratspaltung ergibt. Die Abnahme der Fluoreszenzintensität wurde aufgezeichnet und auf die des Kontrollstrangs (U0) normalisiert. Die in willkürlichen Einheiten angegebenen normalisierten Intensitäten wurden über die Expositionszeit für die chemischen Behandlungen aufgetragen. Das DNA-Array wurde unter sauren Bedingungen (A), alkalischen Bedingungen (B) oder durch Verdampfen der Oberfläche auf Trockenheit (C) und für verschiedene Expositionszeiten behandelt (1, 2, 4, 8, 12 und 20 Stunden)., Die Substratstränge enthielten unterschiedliche Verhältnisse von dU-Nukleotiden, die mit verschiedenen Farben angegeben waren: U0 (schwarz), U1 (rot), U2 (hellgrün), U3 (gelb), U4 (blau), U5 (rosa), U6 (türkis), U7 (grau), U8 (dunkelrot) und U9 (dunkelgrün). Fehlerbalken sind SD.
Unter basischen Bedingungen (Abb. 4B) erfordert die Spaltung von AP-Stellen eine minimale Inkubationszeit von 2 Stunden, um eine signifikante Spaltung (40 bis 60%) der Substrate zu beobachten. Behandeln des Arrays mit einer Säure oder Trocknen seiner Oberfläche (Abb., 4A, C) führt nach nur einer Stunde zu einer klaren und ausgedehnten Spaltung (30 bis fast 80% bei einer sauren Behandlung), wenn die EDA-vermittelte abasische Spaltung nach einer Stunde minimal ist. Es ist wahrscheinlich, dass die Spaltreaktion selbst in A-und C-Verfahren in der letzten Hybridisierungsstufe entweder aufgrund der Temperatur oder aufgrund der Anwesenheit eines Amins im Puffer gefördert wird., Da die Hybridisierung jedoch allen drei Methoden gemeinsam ist, deuten die großen Unterschiede in der Spaltkinetik zwischen basischen und nicht-basischen Behandlungen auf die Möglichkeit hin, dass zusätzliche AP-Stellen in Gegenwart einer Säure oder unter vermindertem Druck erzeugt werden können, wodurch zusätzliche Positionen an den DNA-Strängen entstehen, an denen eine nachfolgende Spaltreaktion auftreten kann. Längere Behandlungen, unabhängig von der Methode, verändern das Ausmaß der Spaltung nicht signifikant und nähern sich in der Regel 40% bis 80%, abhängig von der Anzahl der dU-Einschließungen., In der Tat sehen wir insgesamt eine deutliche Steigerung der Spalteffizienz mit einer zunehmenden Anzahl von dU-Einschließungen unter allen getesteten Bedingungen.
Zusätzlich zur Durchführung einer chemisch induzierten DNA-Strangspaltung an abasischen Stellen wurde die Qualität der Mikroarray-Oberfläche untersucht. Zu diesem Zweck wurde die Gleichmäßigkeit der Merkmale auf den Array-Oberflächen visuell anhand von Fluoreszenzintensitäten untersucht und der Fluoreszenzverlust für die nicht spaltbaren Kontrollstränge überwacht., Wir fanden heraus, dass eine abasische Spaltung unter alkalischen Bedingungen eine spezifische, enzymvermittelte Spaltung von dU-haltigen Sequenzen ermöglichte, die Kontrollsequenzen jedoch praktisch unberührt ließ, während unter sauren Bedingungen auch eine DNA-Strangspaltung für Kontrollstränge beobachtet wurde, denen Uracil-Nukleotide fehlten (Abb. S2). Das Trocknen der Oberfläche führte auch zum Abbau der DT-Only-Kontrollstränge. Da nur eine abasische Spaltung unter alkalischen Bedingungen einen Oberflächenabbau und unspezifischen DNA-Verlust vermeidet, haben wir alle nachfolgenden Experimente unter diesen Bedingungen durchgeführt., Dadurch wird sichergestellt, dass die nicht spaltbaren Kontrollsequenzen auch nach langer chemischer Behandlung zum Vergleich zur Verfügung stehen.
Einzel-und doppelsträngige UDG-Sequenzabhängigkeit
Da unsere Ergebnisse zur E. coli UDG-vermittelten dU-Spaltung nur moderate Spaltwirkungsgrade für DNA-Stränge lieferten, die einzelne dU-Einschließungen enthielten (≈40%), befragten wir die Sequenzspezifität von UDG, um möglicherweise ein hochgespaltenes dU-haltiges Substrat zu identifizieren. Zu diesem Zweck haben wir eine dU-haltige Nukleinsäurebibliothek aus doppel – und einzelsträngigen DNA-Sequenzen entwickelt., Die Bibliothek besteht aus einer 7-Bit-Permutationssequenz mit einem einzigen dU in der Mitte (Abb. 5). Permutation der 3-nt flankierenden Regionen, 5′ – sowie 3′ der dU ergibt 4096 eindeutige Sequenzen. Im doppelsträngigen Format wurden eine Schleife und die komplementäre Sequenz zum 7mer hinzugefügt, was zur Bildung einer Haarnadelstruktur führte. Zusätzliche dG * dC-Basenpaare im Haarnadelstamm halfen bei der Erhöhung der Schmelztemperatur der Haarnadel-DNA-Struktur. Diese Basenpaare wurden zu den einzelsträngigen Substraten hinzugefügt, um die ssDNA-und dsDNA-Designs so ähnlich wie möglich zu halten., Schließlich wurde dem 5′ – Ende jedes Designs ein 25mer-Oligonukleotid zugesetzt, um als Hybridisierungsziel zu dienen. Eine repräsentative Figur der Sequenzdesigns ist in Abb. 5.
Schematische Darstellung des Sequenzdesigns zur Untersuchung von E. coli UDG – Sequenzabhängigkeiten von Einzel-(A) und doppelsträngigen DNA-Substraten., (B) Um die UDG-Sequenzabhängigkeit zu untersuchen, wird ein einzelnes dU in einen DNA-Strang eingearbeitet und von 3 permutierten Basen auf jeder Seite umschlossen. A Das Design für die Untersuchung der UDG-Sequenzabhängigkeit von einzelsträngigen DNA-Substraten besteht aus einem 15mer dT-Linker, einer einzelnen dU, die von 3 permutierten Basen auf jeder Seite umschlossen ist, gefolgt von einer 5′ 25mer-Sequenz (QC25), die als Ziel für die Hybridisierung zu ihrem 3′-Cy3-markierten komplementären Oligonukleotid (QC25c) dient. B Für die Untersuchung der UDG-Sequenzabhängigkeit von doppelsträngigen DNA-Substraten wurden die Sequenzen entwickelt, um eine Haarnadelschleife zu bilden., Die resultierenden Stränge bestanden aus einem 15-dT-Linker, einem 11-nt-Stiel, der dem einzelsträngigen Design entspricht und den variablen Bereich enthält, der von dG·dC-Basispaaren flankiert wird, einer 4-nt-Schleife, gefolgt von dem komplementären 11nt-Strang. Am 5 ‚ – Ende wurde eine hybridisierbare 25mer-Zielsequenz (QC25) synthetisiert.,
Obwohl die terminale Kennzeichnung von DNA mit einem Fluoreszenzfarbstoff eine bequeme Methode zur direkten Messung der Fluoreszenzintensität ist, hat dies den Nachteil eines hohen Fluoreszenzrauschens, das insbesondere bei Mikroarrays mit hoher Dichte die Datenextraktion und-interpretation erschwert. Daher haben wir uns entschieden, die Spaltreaktion über Hybridisierung zu den immobilisierten Sequenzen zu überwachen., Vor der Behandlung mit UDG wurden die einzel-und doppelsträngigen DNA-Substrate mit dem markierten komplementären 25mer-Oligonukleotid hybridisiert und gescannt, um anfängliche Fluoreszenzwerte zu erhalten. Dann wurden die Mikroarrays für verschiedene Zeiträume UDG ausgesetzt. Nach der folgenden AP-Site-Spaltung unter alkalischen Bedingungen wurden die Arrays erneut zu ihren Cy3-markierten Ergänzungen hybridisiert. Die Abnahme des Fluoreszenzsignals der DNA-Stränge relativ zu Vorbehandlungsfluoreszenzwerten entspricht direkt der Spalteffizienz., Maximale Spaltwirkungsgrade von etwa 40% wurden für doppelsträngige Substrate nach UDG-Inkubation für 2 Minuten und etwas niedrigere Spaltraten für einzelsträngige Substrate erhalten (Tabelle S1). Diese niedrigere Rate für einzelsträngige widerspricht früheren Studien,aus denen hervorgeht,dass sie schneller gespalten sind als ihre doppelsträngigen Äquivalente13, 47, 48. Interessanterweise führen sehr kurze Enzyminkubationen (<1 min) immer noch zu signifikanten Spalteffekten (30-35%)., Diese kurzen Zeitpunkte sind besonders interessant, da sie klare Hinweise auf mögliche Sequenzpräferenzen geben. Um die Sequenzabhängigkeit beim UDG-vermittelten DNA-Abbau aus unserem Satz von 4096 einzelnen Strängen zu identifizieren, konzentrierten wir uns auf den 1% (Abb. 6) sowie 5% (Abb. S3) der am wenigsten gespaltenen Teilmenge von Sequenzen. Repräsentative Sequenzmotive, die aus diesen Sequenzuntermengen erzeugt werden, sind in Fig. 6 und in den Ergänzenden Informationen.,
Repräsentative Sequenzmotive für die UDG-vermittelte Uracil – Spaltung auf Doppel-(A,B) und einzelsträngigen (C,D) DNA-Strängen. Substrate wurden mit UDG für verschiedene Zeiträume von 5 Sekunden bis 30 Minuten inkubiert (da die Spaltmotive wenig bis keine Sequenzabhängigkeit zeigten, wurden nur die 5s, 30s, 60s und 120s für ssDNA bestimmt)., Die Sequenzmotive wurden aus den 1% (41 von 4096 Sequenzen) am meisten gespaltenen (A,C) und am wenigsten gespaltenen (B,D) Sequenzen der Bibliothek extrahiert.
Für doppelsträngige DNA (Abb. 6A, B) zeigen die Ergebnisse eine klare UDG-Sequenzpräferenz für G/C-reiche Regionen, die Uracil flankieren. Umgekehrt scheint UDG doppelsträngige Substrate, die T·A-Basispaare enthalten, schlecht zu verarbeiten. Die Motive, die aus besseren und schlechteren Substraten gewonnen werden,stimmen teilweise mit den sehr begrenzten vorhandenen Literaturdaten48,49, 50 überein. Seibert et al., es wurde die Hypothese aufgestellt, dass die Effizienz von E. coli UDG mit den energetischen Kosten der DNA-Biegung und-verzerrung zusammenhängt, die bei der Erkennung spezifischer Schäden auftreten. In Molekulardynamiksimulationen und zeitaufgelösten Fluoreszenzexperimenten mit zwei Uracil-haltigen doppelsträngigen DNA-Sequenzen stellten sie fest, dass die effektiven Biegekraftkonstanten niedriger sind, wenn sich dAs oder dTs neben dem Uracil-Nukleotid befinden, anstelle von dGs und dCs; was darauf hindeutet, dass dA/dT-reiche Sequenzen durch UDG leichter gebogen und somit besser verarbeitet werden49., Da einzelsträngige DNA eine viel flexiblere Form von DNA ist,könnte ihre schnellere Verarbeitung,die in der Literatur berichtet wird,auf die niedrigeren energetischen Kosten von Spaltsubstraten zurückzuführen sein, die von Natur aus flexibler sind als dsDNA7, 47, 49, 51. Dies kann jedoch kein entscheidender Faktor für die UDG-Spaltspezifität von ssDNA sein, da das Enzym alle Substrate gleich gut erkennt und spaltet, was möglicherweise das Fehlen eines Sequenzkonsens in dU-haltiger ssDNA erklärt., Es wurde jedoch die Hypothese aufgestellt, dass Sequenzkontexteffekte sich immer noch auf einzelsträngige DNA erstrecken und tatsächlich für UDG vom Herpes-simplex-Virus Typ 152 beobachtet worden waren, für Human-oder E. coli-UDG jedoch noch unklar ist. Slupphaug et al. maß die Sequenzspezifität von humanem UDG in 34 dsDNA-Sequenzkontexten und vermutete, dass dT 3 ‚ bis dU immer zu einer langsamen Entfernung führt, ebenso wie, etwas diskordant, ein hoher GC-Gehalt50. Eftedal et al. bewertete die Spalteffizienz von Kalbsthymus und E. coli UDG aus 41 dsDNA-Sequenzen und fand ein ähnliches Muster., Mit unserem weitaus größeren Satz von Sequenzen können wir uns einig sein, dass dT 3′ zu dU immer zu einer langsamen Entfernung führt, aber unsere Daten zeigen deutlich, dass dC und dG in geringerem Maße 3‘ zu dU zu einer schnellen Entfernung führen. Wir konnten keine signifikante Sequenzabhängigkeit für die dU-Exzision auf ssDNA identifizieren (Abb. 6C,D). Es sollte beachtet werden, dass die Sequenzabhängigkeit in dsDNA-Substraten für kurze enzymatische Behandlungen (5s, 30s, 60s und 120s) klar ist, aber langsam für eine längere UDG-Exposition (30min) verschwindet, was darauf hinweist, dass alle Substrate schließlich gespalten werden, wenn sie dem Enzym ausgesetzt werden.,
Spaltstellenoptimierungen
Da aus unseren Studien keine signifikante Sequenzabhängigkeit für die UDG-vermittelte Uracil-Exzision auf einzelsträngige DNA hervorging und eher moderate Spaltungseffizienzen für einzelne dU-Integrationen erzielt wurden, haben wir uns für die UDG-vermittelte dU-Exzision auf längeren einzelsträngigen Substraten mit verschiedenen Formen multipler dU-Integrationen entschieden, um spezifische Spaltungsstellen zu identifizieren, die leicht enzymatisch zugänglich sind und eine schnelle und effiziente Strangspaltung ermöglichen., Unsere Begründung ist, dass eine Vergrößerung des Abstands der Sonde von der Oberfläche eine größere Zugänglichkeit für die Spaltung bieten sollte, aber dieser Effekt kann nicht auf lange Abstandshalter übertragen werden (>20-nt)53. Basierend auf den Ergebnissen aus Abb. 3 erwarten wir auch, dass eine höhere Anzahl von dU-Einschließungen zu einer größeren Gesamtspaltung führt, aber wir fragen uns, ob es eine optimale Dichte von dU-Nukleotiden innerhalb des spaltbaren Abschnitts des DNA-Strangs gibt. Daher untersuchten wir die Uracil-Spaltung an längeren dU-Homopolymeren (10, 15 und 20%) sowie an Oligomeren mit variierender % dU-Zusammensetzung., Der Prozentsatz von dU innerhalb des Oligomers wurde relativ zu den anderen vier Nukleotiden (dA, dC, dG und dT) berechnet und experimentell erreicht, indem Kopplungsreaktionen mit vorgemischten Lösungen von dU/dA/dC/dG/dT-Phosphoramiditen in verschiedenen Verhältnissen durchgeführt wurden (0:100, 12:88, 25:75, 50:50 oder 100: 0, (v/v) dU: dA / dC / dG / dT). Die Sequenzen, die auf Poly-dT-Linkern unterschiedlicher Länge (dT1, dT5, dT10 und dT15) aufgebaut sind, und der dU-haltige Bereich wurden dann mit einer 25mer-Zielsequenz für Hybridisierungszwecke beendet, wie in Fig. 7.,
Die Spalteffizienz von einzelsträngigen Substraten mit UDG-oder Benutzerenzymen. Es werden drei Parameter untersucht: Linker Länge (in blau), dU-haltige Segmentlänge (10, 15 oder 20-nt lang in schwarz, grau bzw. hellgrau) und dU-Gehalt (von 0 bis 100% auf der x-Achse). Alle Substrate werden am 5ʹ-Ende mit einer 25mer-hybridisierbaren Sequenz beendet., Die entsprechenden Mikroarrays wurden entweder mit UDG oder Benutzerenzym (5 U, 1 h bei 37 °C) und anschließend, im Falle einer UDG-Behandlung, mit EDA/EtOH für 2 h bei r. t behandelt.Der Spaltwirkungsgrad entspricht dem Verlust der Hybridisierungsfluoreszenz nach enzymatischer Behandlung und relativ zu 0% dU-Kontrollen.
Nach der Synthese wurde der 25mer mit seinem komplementären 5′-Cy3-markierten Oligonukleotid hybridisiert und das Mikroarray wurde 1 Stunde lang UDG ausgesetzt., Dann wurde die Spaltung der abasischen Stelle unter alkalischen Bedingungen durchgeführt, gefolgt von einer endgültigen Rehybridisierung. Parallel dazu haben wir auch den Spalt-Assay mit dem Benutzerenzym durchgeführt, wodurch in diesem Fall ein zusätzliches Abasic Site Cleavage-Verfahren überflüssig wird.
Für den Enzym-Assay mit UDG gefolgt von einer Abasic-Site-Spaltung unter alkalischen Bedingungen (Abb. 7, links) verzeichneten wir Spaltwirkungsgrade von 4% bis 80% und mit klaren Trends., Beispielsweise steigt die Spalteffizienz mit zunehmender Länge des dU-haltigen Bereichs signifikant an, in der Reihenfolge 10mer > 15mer > 20mer, wobei ein Maximum von ~50% Spaltung für einen 10mer dU-Bereich und 80% Maximum für den 20mer dU-Bereich erreichbar ist. In ähnlicher Weise führen längere Linker zu einer insgesamt höheren Spaltrate. Diese Beobachtungen zeigen, dass längere Sequenzen besser erkannt und die entsprechenden Uracil-Basen durch UDG besser ausgeschnitten werden, was wiederum auf eine größere Zugänglichkeit der längeren Substrate durch das Enzym hindeutet., Die Spalteffizienz wird auch durch die Menge an dU-Nukleotiden innerhalb des spaltbaren Teils des Substrats beeinflusst. In der Tat sind Uracil-Homopolymere (100% dU) fast immer weniger gespalten als ihre Kongenere mit eingestreuten dU-Nukleotiden, und dieser Effekt ist besonders deutlich, wenn die Substrate über einen kurzen T1-Linker synthetisiert werden. Andererseits wird eine Erhöhung des dU-Gehalts von 12 auf 50% mit einer zunehmenden Spalteffizienz einhergehen, wobei 50% dU die optimale Menge zu sein scheint., Somit war die UDG-vermittelte Spaltung unter unseren experimentellen Bedingungen die effizienteste auf den längsten Substraten, auf denen die Hälfte der Nukleotide im spaltbaren Teil dU ist (80% Spaltungseffizienz). Dieser Trend sowie Daten in Abb. 3, legt nahe, dass UDG mehrere dU-Integrationen erkennen und binden kann, solange dUs durch kanonische DNA-Nukleotide getrennt sind.
Während kurze Homopolymere im Allgemeinen als schlechte UDG-Substrate bekannt sind, erwarteten wir auch niedrige Spaltraten für die 20mer-spaltbaren Regionen, da solche Substrate wahrscheinlich nicht in DNA zu finden sind., In vivo treten Uracil-Basen hauptsächlich in DNA-Strängen aufgrund einer Fehlinkorporation während der Replikation oder aufgrund einer Desamination auf8, 9 und es ist unwahrscheinlich,dass beide Prozesse bei einer so hohen Häufigkeit zur Bildung von Homopolymeren auftreten. Dennoch wurden moderate bis hohe Spaltwirkungsgrade von etwa 60% auf langen 20mer dU-Homopolymeren erhalten, aber ob diese Homopolymere langsamer verarbeitet werden als Substrate mit niedrigerem %dU-Gehalt, bleibt zu untersuchen.
Behandlung einer ähnlichen DNA-Array-Bibliothek mit dem Benutzerenzymsystem (Abb., 7, rechts) führt zu einer zufriedenstellenden Spaltung einzelsträngiger Substrate, wobei Spalt-Trends etwas mit dem UDG-Fall vergleichbar sind, jedoch mit einigen bemerkenswerten Ausnahmen. Erstens ist die höchste Spalteffizienz niedriger als für das UDG / EDA-System (55% gegenüber 80%), was auf eine langsamere Verarbeitung der abasischen Stellen mit Endonuklease VIII im Vergleich zu einer gemeinsamen Basisbehandlung mit EDA zurückzuführen ist., Zweitens scheint es eine schwächere Längendiskriminierung im spaltbaren Bereich im Vergleich zu UDG/EDA zu geben, mit höchstens 20-25% Unterschied zwischen kurzen (10-nt) und langen (20-nt) dU-haltigen Regionen, wenn die UDG allein Behandlung führte zu großen Schwankungen in der Spalteffizienz der gleichen 10 und 20% (bis zu 50% Unterschied). Auch dieser Effekt könnte auf Unterschiede in der Verarbeitungsrate von AP-Sites zurückzuführen sein. Schließlich scheinen dU-Homopolymere unabhängig von der Linker-oder Substratlänge in gleichem Maße abgebaut zu sein., Dieser Mangel an Diskriminierung im Fall des Benutzerenzyms und im Vergleich zu UDG-vermittelten Spaltdaten legt nahe, dass das Vorhandensein mehrerer aufeinanderfolgender AP-Stellen der limitierende Faktor bei der enzymatischen Entfernung von AP-Stellen ist.
Zusammenfassend haben wir festgestellt, dass mit der UDG-vermittelten Spaltung, gefolgt von einer EDA-Behandlung auf längeren, nicht homopolymeren Uracil-haltigen Substraten, die besten Spaltungseffizienzen erzielt werden können. Dabei können einzelsträngige Sequenzen, die 50% dU enthalten, effizient gespalten werden, wenn auch in zwei Schritten., Eine kurze, einstufige Behandlung mit dem Anwenderenzymcocktail kann auch bequem bis zu 50% dU-haltige Einzelstränge in einer Stunde spalten, jedoch kann die scheinbar geringere Unterscheidungskraft dieser speziellen enzymatischen Behandlung weniger nützlich sein, wenn eine bevorzugte Spaltung erforderlich ist.