Was ist Durchflusszytometrie (FACS-Analyse)?

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Verschiedene Lichtarten, die in einem Durchflusszytometrieexperiment verwendet werden

Ein Durchflusszytometer verwendet gebrochenes oder emittiertes Licht, um Zellen zu zählen und zu identifizieren. In den folgenden Abbildungen erfahren Sie mehr über verschiedene Lichtarten, die in einem Durchflusszytometrieexperiment verwendet werden.,

Forward Scatter

Forward Scatter Licht wird durch eine Zelle im Strömungskanal gebrochen und setzt sich im Lichtweg fort (dh in die gleiche Richtung, in die sich das Licht ursprünglich bewegte). Vorwärts gestreutes Licht wird von einem Sensor im Lichtweg detektiert und wird typischerweise verwendet, um die Partikelgröße zu identifizieren.

Vorwärts Streulicht wird am häufigsten verwendet, um die Größe des Objekts im Lichtweg zu erkennen., Größere Objekte erzeugen mehr vorwärtsgestreutes Licht als kleinere Objekte, und größere Zellen haben ein stärkeres Vorwärtsstreusignal

Seitenstreuung

Seitenstreutes Licht geht von der Beleuchtungsquelle in den Flusskanal über, wird von Zellen in eine Richtung gebrochen, die außerhalb des Originals liegt.lichtweg. Seitengestreutes Licht wird von einem Sensor erfasst, der orthogonal zum ursprünglichen Lichtweg ist.,

Seitengestreutes Licht wird üblicherweise verwendet, um eine Bestimmung hinsichtlich der Granularität und Komplexität der Zelle im Lichtweg vorzunehmen. Hochgranuläre Zellen mit einer großen Menge an interner Komplexität, wie Neutrophile, erzeugen mehr seitenstreutes Licht und ein höheres Seitenstreusignal als Zellen mit einer geringen Granularität und Komplexität.

Fluoreszenzemission

Fluoreszenzlicht wird von fluoreszierenden Molekülen nach Anregung durch einen kompatiblen Wellenlängenlaser emittiert., Fluoreszierendes Licht kann von natürlich fluoreszierenden Materialien in der Zelle stammen oder von fluoreszierenden Farbstoffen oder fluoreszenzmarkierten Antikörpern stammen, die verwendet wurden, um eine bestimmte Struktur auf der Zelle zu kennzeichnen.

Multiparametrische Analyse

Ein Scheindurchflusszytometrie-Punktdiagramm, das vorwärts gegen seitlich verstreut aus einer Population von Leukozyten zeichnet., Zellpopulationen zeichnen sich durch ihre wahrscheinliche Identität aus:

D Vermutete Trümmer, sehr kleine Gegenstände mit geringer Vorwärts – und Seitenstreuung.

L / M Wahrscheinliche Leukozyten / Monozyten, kleine bis mittlere Zellen mit geringer interner Komplexität / Granularität. Diese Zellen erzeugen eine mittlere Vorwärts-Streuung und niedrige Seitenstreusignalintensität

G Wahrscheinliche Granulozyten, große Zellen mit hoher interner Komplexität/Granularität. Diese Zellen erzeugen hohe Vorwärts-und Seitenstreusignale.,

Während einige Identitäten durch Vorwärts-und Seitenstreuungsprofile bestätigt werden können, bietet die Kennzeichnung mit einem zelltypspezifischen Marker immer eine größere Auflösung und Sicherheit bei der Profilierung komplexer heterogener Zellpopulationen.

Zum Beispiel kann ein Forscher in der obigen Darstellung unter Verwendung von Vorwärts-und Seitenstreulicht zwischen Granulozyten und Lymphozyten unterscheiden. Drei Klassen von Granulozyten (Neutrophile, Basophile und Eosinophile) sind jedoch in Größe und Struktur sehr ähnlich und verleihen ihnen ähnliche lichtstreuende Eigenschaften., In diesem Fall könnten Neutrophile aufgrund ihrer Expression selektiv als neutrophilenspezifischer Marker wie ELAN markiert werden.

FACS: Sortieren von Zellen anhand von Durchflusszytometriedaten

Häufig werden die Begriffe Durchflusszytometrie und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) synonym verwendet. In der Praxis gibt es Unterschiede zwischen den beiden Methoden.

FACS ist ein Derivat der Durchflusszytometrie, das einen außergewöhnlichen Grad an Funktionalität hinzufügt. Mit FACS kann ein Forscher eine heterogene Mischung von Zellen physisch in verschiedene Populationen sortieren.,

Durch die Verwendung hochspezifischer Antikörper, die mit fluoreszierenden Farbstoffen markiert sind, kann ein Forscher eine FACS-Analyse durchführen und gleichzeitig Daten über eine Probe mit einer nahezu unbegrenzten Anzahl verschiedener Parameter sammeln und sortieren.

In einem FACS-Experiment:

• Vorwärts -, Seiten-und Fluoreszenzdaten werden gesammelt, wie in der konventionellen Durchflusszytometrie.
• Benutzerdefinierte Parameter geben Auskunft darüber, wie Zellen sortiert werden sollen.
• Basierend auf diesen Parametern verwendet die FACS-Maschine eine Elektrode, um jeder Zelle eine elektrische Ladung aufzuerlegen.,
• Beim Verlassen der Strömungskammer sortieren Elektromagnete Zellen nach Ladung in separate Gefäße.

Wie sehen Durchflusszytometriedaten aus?

In einem Durchflusszytometrieexperiment wird jede Zelle, die das Durchflusszytometer durchläuft und detektiert wird, als eindeutiges Ereignis klassifiziert.

Zusätzlich wird jeder Lichtart, die vom Durchflusszytometer erfasst wird (Vorwärtsstreuung, Seitenstreuung und jede Wellenlänge der Fluoreszenzemission), ein eigener Kanal zugewiesen., Durchflusszytometriedaten zeichnen jedes Ereignis unabhängig voneinander auf und stellen die Signalintensität des in jedem Kanal für jedes Ereignis detektierten Lichts dar.

Durchflusszytometriedaten werden typischerweise auf zwei Arten dargestellt: Histogramme, die nur einen einzelnen Parameter messen oder vergleichen, und Punktdiagramme, die 2 oder 3 Parameter gleichzeitig auf einem zwei-oder dreidimensionalen Streudiagramm vergleichen.

Ein Histogramm zeichnet typischerweise die Intensität, die in einem einzelnen Kanal entlang einer Achse erfasst wird, und die Anzahl der Ereignisse, die bei dieser Intensität erfasst werden, befindet sich in einer separaten Achse., Eine große Anzahl von Ereignissen, die bei einer bestimmten Intensität erkannt werden, wird als Spitze im Histogramm angezeigt.

Im Gegensatz dazu wird in einem Punktdiagramm jedes Ereignis als einzelner Punkt auf einem Streudiagramm dargestellt. Die Intensität von 2 verschiedenen Kanälen (oder 3 verschiedenen Kanälen in einem dreidimensionalen Diagramm) wird entlang der verschiedenen Achsen dargestellt. Ereignisse mit ähnlicher Intensität gruppieren sich in derselben Region auf dem Streudiagramm.

Histogramme und Punktdiagramme bieten unterschiedliche Vorteile für die Durchflusszytometrie-Datenanalyse. Die Wahl, wie Ihre Daten am besten dargestellt werden sollen, kann dazu beitragen, dass eine vollständige Geschichte in einem einfachen, verständlichen Format erzählt wird.

Punktdiagramme und Histogramme schließen sich nicht gegenseitig aus, und die komplexesten Durchflusszytometrieexperimente verwenden mehrere Diagramme, um umfangreiche, multiparametrische Daten auf einer Probe anzuzeigen.

In vielen Fällen müssen mehr als drei Parameter gleichzeitig gezeichnet werden., In diesem Fall kann eine als Gating bekannte Datenanalysetechnik dazu beitragen, zusätzliche Auflösung und Flexibilität zu erzielen, wodurch eine nahezu unbegrenzte Anzahl von Parametern gleichzeitig über mehrere verschiedene Streudiagramme und Histogramme hinweg analysiert werden kann.

Gating fügt Durchflusszytometriedaten eine Auflösung hinzu

Kurz gesagt, Gating ist eine Methode zur Auswahl von Zellen aus einem Durchflusszytometrieexperiment, das Sie genauer analysieren möchten., Gating ermöglicht es einem Forscher, mehr Informationen über eine Subpopulation von Zellen zu sammeln und anzuzeigen, als normalerweise auf einem 2 – oder 3-dimensionalen Punktdiagramm angezeigt werden könnten.

Gating fügt einem Durchflusszytometrieexperiment eine Auflösung hinzu und ermöglicht die gleichzeitige Analyse einer nahezu unbegrenzten Anzahl verschiedener Parameter (Kanäle).

In einem Gated Flow Cytometry Experiment:

• sammelt ein Benutzer Durchflusszytometriedaten von einem oder mehreren Kanälen auf einem Punktdiagramm.
• Basierend auf den erfassten Daten zeichnet der Benutzer eine Gate-Box, in der eine Unterbevölkerung von Zellen zur weiteren Analyse ausgewählt wird.,
• Die Subpopulation von Zellen innerhalb des Gatters wird speziell auf anderen Diagrammen hervorgehoben, die Informationen aus alternativen Kanälen anzeigen.

Gates verleihen der Durchflusszytometrie eine unglaubliche Flexibilität und ermöglichen eine Auflösung von bis zu Einzelzellen für jeden Kanal, der dem Forscher zur Verfügung steht. Für ein einzelnes Streudiagramm können mehrere Gates eingerichtet und Gates „gestapelt“ und kombiniert werden (dh eine Subpopulation von Zellen, die in den Kanälen 1 und 2 gated sind, kann für die Kanäle 3 und 4 weiter gated werden, um mehr Spezifität und tiefere Analyse zu ermöglichen).,

Ein Beispiel für gating

Ein Hinweis zur Kompensation

Spillover von einem Kanal in einen anderen kann fälschlicherweise als positiv identifizierte Signale verursachen. Spillover ist das Artefaktsignal, das ein fluoreszierender Farbstoff in Abhängigkeit von seiner relativen Helligkeit und seinem Emissionsspektrum im Kanal eines anderen Fluorophors verursachen kann. Hier kommt die Entschädigung ins Spiel. Die Kompensation ist ein Verfahren, das das Signal von einem bestimmten Kanal von den anderen Kanälen isoliert, die im selben Experiment verwendet werden. FITC z.B., hat seine Emissionsspitze im grünen Bereich des elektromagnetischen Spektrums. Es fluoresziert jedoch auch im gelben Kanal, wo PE Licht emittiert. Einfach ausgedrückt subtrahiert die Kompensation das FITC-Signal vom PE-Kanal.

Dieses Signal im“ falschen “ Kanal wird von dem durch den interessierenden Fluorophor verursachten Signal subtrahiert. In der obigen Probe ist das Verhältnis der grünen und der gelben Komponente bei einer gegebenen Anregungswellenlänge für FITC konstant., Es ist somit möglich, die Menge des unspezifischen gelben FITC-Signals im PE-Kanal aus der Messung im grünen Kanal unter Verwendung der konstanten Kompensationskoeffizienten abzuleiten. Gleiches gilt für den Überlauf vom PE in den FITC-Kanal.