SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese) wird üblicherweise im Labor zur Trennung von Proteinen auf der Grundlage ihres Molekulargewichts verwendet. Es ist eine dieser Techniken, die häufig verwendet wird, aber nicht häufig vollständig verstanden wird. Also versuchen wir das zu beheben.
SDS-PAGE trennt Proteine nach ihrem Molekulargewicht, basierend auf ihren unterschiedlichen Migrationsraten durch eine Siebmatrix (ein Gel) unter dem Einfluss eines angelegten elektrischen Feldes.,
Die Geschwindigkeit der Proteinmigration proportional zum Molekulargewicht
Die Bewegung einer geladenen Spezies durch ein elektrisches Feld wird durch ihre Nettoladung, ihren Molekularradius und die Größe des angelegten Feldes bestimmt. Das Problem bei nativ gefalteten Proteinen ist jedoch, dass weder ihre Nettoladung noch ihr Molekularradius molekulargewichtsabhängig sind. Stattdessen wird ihre Nettoladung durch die Aminosäurezusammensetzung bestimmt, dh die Summe der positiven und negativen Aminosäuren im Protein und der Molekülradius durch die Tertiärstruktur des Proteins.,
So würden in ihrem nativen Zustand verschiedene Proteine mit dem gleichen Molekulargewicht mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten in einem elektrischen Feld wandern, abhängig von ihrer Ladung und 3D-Form.
Um Proteine in einem elektrischen Feld nur aufgrund ihres Molekulargewichts zu trennen, müssen wir die Tertiärstruktur zerstören, indem wir das Protein zu einem linearen Molekül reduzieren und irgendwie die intrinsische Nettoladung des Proteins maskieren. Da kommt SDS ins Spiel.,
Die Rolle von SDS (et al)
SDS ist ein Reinigungsmittel, das im SDS-PAGE-Probenpuffer vorhanden ist, wo es zusammen mit etwas Kochen und einem Reduktionsmittel (normalerweise DTT oder B-ME zum Abbau von Protein-Protein-Disulfid-Bindungen) die Tertiärstruktur von Proteinen stört. Dadurch werden die gefalteten Proteine zu linearen Molekülen.
SDS beschichtet das Protein auch mit einer gleichmäßigen negativen Ladung, die die intrinsischen Ladungen auf den R-Gruppen maskiert. SDS bindet ziemlich gleichmäßig an die linearen Proteine (um 1.,4g SDS / 1g Protein), was bedeutet, dass die Ladung des Proteins jetzt ungefähr proportional zu seinem Molekulargewicht ist.
SDS ist auch im Gel vorhanden, um sicherzustellen, dass die Proteine, sobald sie linearisiert und ihre Ladungen maskiert sind, während des gesamten Laufs so bleiben.
Der dominierende Faktor bei der Bestimmung eines SDS-beschichteten Proteins ist sein Molekularradius., Es wurde gezeigt, dass SDS-beschichtete Proteine lineare Moleküle sind, 18 Angstroms breit und mit einer Länge proportional zu ihrem Molekulargewicht, so dass der Molekularradius (und damit ihre Beweglichkeit im Gel) durch das Molekulargewicht des Proteins bestimmt wird. Da die SDS-beschichteten Proteine das gleiche Verhältnis von Ladung zu Masse haben, wird es keine differentielle Migration basierend auf der Ladung geben.
Die Gelmatrix
In einem angelegten elektrischen Feld bewegen sich die mit SDS behandelten Proteine nun je nach Molekulargewicht mit unterschiedlichen Raten in Richtung der positiven Anode., Diese unterschiedlichen Mobilitäten werden aufgrund der reibungsstarken Umgebung einer Gelmatrix übertrieben.
Wie der Name schon sagt, ist die für SDS-PAGE verwendete Gelmatrix Polyacrylamid, was eine gute Wahl ist, da es chemisch inert ist und, entscheidend, leicht in einer Vielzahl hergestellt werden kann Konzentrationen, um verschiedene Porengrößen zu erzeugen, die eine Vielzahl von Trennbedingungen ergeben, die je nach Bedarf geändert werden können. Sie erinnern sich vielleicht, dass ich zuvor einen Artikel über den Mechanismus der Acrylamidpolymerisation geschrieben habe.,
Das diskontinuierliche Puffersystem und das Stapelgel-sie an der Startlinie auskleiden
Um den Strom von der Kathode (negativ) zur Anode (positiv) durch das Gel zu leiten, wird offensichtlich ein Puffer benötigt. Meistens verwenden wir das diskontinuierliche Laemmli-Puffersystem. „Diskontinuierlich“ bedeutet einfach, dass der Puffer im Gel und im Tank unterschiedlich ist.
Typischerweise wird das System mit einem Stapelgel bei pH 6,8, gepuffert durch Tris-HCl, einem laufenden Gel gepuffert bei pH 8,8 durch Tris-HCl und einem Elektrodenpuffer bei pH 8,3 aufgebaut., Das Stapelgel hat eine niedrige Konzentration an Acrylamid und das laufende Gel eine höhere Konzentration, die die Bewegung der Proteine verzögern kann.
Also, was ist mit all diesen verschiedenen pH-Wert ist?
Nun, Glycin kann je nach pH-Wert in drei verschiedenen Ladezuständen existieren, positiv, neutral oder negativ. Die Kontrolle des Ladezustands des Glycins durch die verschiedenen Puffer ist der Schlüssel zum gesamten Stapelgel.,
So funktioniert das Stapelgel. Wenn die Stromversorgung eingeschaltet ist, werden die negativ geladenen Glycinionen im pH 8.3-Elektrodenpuffer gezwungen, in das Stapelgel einzutreten, wo der pH 6.8 beträgt. In dieser Umgebung wechselt Glycin überwiegend in den zwitterionischen (neutral geladenen) Zustand. Dieser Ladungsverlust bewirkt, dass sie sich im elektrischen Feld sehr langsam bewegen.
Die Cl-Ionen (von Tris-HCl) bewegen sich dagegen im elektrischen Feld viel schneller und bilden eine Ionenfront, die vor dem Glycin wandert., Die Trennung von Cl – vom Tris-Gegenion (das sich jetzt in Richtung Anode bewegt) erzeugt eine schmale Zone mit einem steilen Spannungsgradienten, der das Glycin dahinter zieht, was zu zwei eng getrennten Fronten wandernder Ionen führt; die hochbewegliche Cl – Front, gefolgt von der langsameren, meist neutralen Glycinfront.,
Alle Proteine in der Gelprobe haben eine elektrophoretische Beweglichkeit, die zwischen dem Extrem der Beweglichkeit von Glycin und Cl-liegt, also wenn die beiden Fronten durch die Probe gut fegen, werden die Proteine in die enge Zone zwischen den Cl – und Glycinfronten konzentriert.
Und Sie sind Weg!
Diese Prozession geht weiter, bis sie auf das laufende Gel trifft, wo der pH-Wert auf 8,8 wechselt. Bei diesem pH-Wert sind die Glycinmoleküle meist negativ geladen und können viel schneller wandern als die Proteine., So beschleunigt die Glycinfront an den Proteinen vorbei und hinterlässt sie im Staub.
Das Ergebnis ist, dass die Proteine in einem sehr schmalen Band an der Grenzfläche der Stapel-und Laufgele abgeladen werden und da das Laufgel eine erhöhte Acrylamidkonzentration aufweist, die die verlangsamt Die Bewegung der Proteine entsprechend ihrer Größe beginnt die Trennung.
Was War Das Alles Über?
Wenn Sie immer noch Fragen, warum die stacking-gel ist notwendig, zu denken, was passieren würde, wenn Sie nicht ein.,
Gel brunnen sind um 1 cm tief und sie müssen in der regel im wesentlichen füllen sie zu erhalten genug protein auf die gel. In Ermangelung eines Stapelgels würde Ihre Probe als bis zu 1 cm tiefes Band auf dem laufenden Gel sitzen.
Anstatt zusammen aufgereiht zu sein und das laufende Gel zusammen zu treffen, würde dies bedeuten, dass die Proteine in Ihrer Probe alle zu unterschiedlichen Zeiten in das laufende Gel gelangen, was zu sehr verschmierten Bändern führt.,
So stellt das Stapelgel sicher, dass alle Proteine gleichzeitig im laufenden Gel ankommen, so dass Proteine desselben Molekulargewichts als enge Bänder wandern.
Trennung
Sobald sich die Proteine im laufenden Gel befinden, werden sie getrennt, da sich Proteine mit höherem Molekulargewicht langsamer durch das poröse Acrylamidgel bewegen als Proteine mit niedrigerem Molekulargewicht. Die Größe der Poren im Gel kann abhängig von der Größe der Proteine, die Sie trennen möchten, durch Ändern der Acrylamidkonzentration geändert werden. Typische Werte sind unten dargestellt.,
Für einen breiteren Trennbereich oder für schwer zu trennende Proteine kann ein Gradientengel mit Schichten zunehmender Acrylamidkonzentration verwendet werden.