DNA-Geelielektroforeesi on tekniikka, jolla DNA-fragmentit voidaan erottaa ja tunnistaa koon perusteella.
DNA-fragmentteja erikokoisia ladataan huokoinen geeli valmistettu agaroosi – hiilihydraatti löytyy punainen levät.
Kun sähkökenttä on sovellettu, fragmentit siirtyvät kautta geeli, kiitos negatiivisesti varautunut fosfaatti ryhmien DNA: n nukleotidien.
pienemmät DNA-kappaleet siirtyvät geelin läpi helpommin kuin suuremmat fragmentit, joiden on vaikeampi liikkua geelimatriisin läpi.,
Kun geeli run on täydellinen sijainti DNA-näytteitä voidaan verrata sarja fragmentteja tai bändeistä tunnettu koot, kutsutaan DNA-ladder.
läsnäolo katkelma edun voi sitten olla vahvistanut, joka perustuu sen kokoon, joka määritetään vertaamalla suhteellinen sijainti testattava näyte sirpaleet tikkaat.
Agarose-geelit valmistetaan painon mukaan tilavuusprosenttiliuoksella. Joten 1 gramma agaroosia 100 ml: ssa puskuria tekee 1% geeliä., Pienempi prosenttia geelit paremmin ratkaista suurempia fragmentteja ja suurempi prosenttia geelit tekevät pienempiä fragmentteja helpompi tunnistaa. Geelinvalmistuksen käynnistämiseksi punnitaan agaroosin sopiva massa erlenmeyerpulloon.
Lisää juokseva puskuri pulloon siten, että puskurin tilavuus on enintään 1/3 pullon tilavuudesta. Sekoita sitten.
sulata agarose / puskuriseos kuumentamalla mikrossa maksimiteholla. Kolmisenkymmentä sekuntia, poista pullo ja pyörittele sisältö sekoitetaan hyvin. Toista, kunnes agaroosi on täysin liuennut.,
lisää seuraavaksi etidiumbromidi pitoisuudeksi 0, 5 mg / ml. Etidiumbromidi on aromaattinen yhdiste, joka sopii yksittäisten emäsparia DNA: ta, tai intercalates, ja aiheuttaa DNA päästää voimakkaan oranssi fluoresenssi UV-valossa. On tärkeää huomata, että etidiumbromidi on syöpää aiheuttava aine, joten käsineitä on aina käytettävä käsiteltäessä tätä yhdistettä sisältäviä geelejä.
estää geeli lokero loimitus, anna agaroosi viileä asettamalla se 65ȘC vesihauteessa.
Kun agaroosi on jäähdytys, valmistaa geeli homeen asettamalla geeli lokero osaksi valu laitteet., Vaihtoehtoisesti voit käyttää teippiä geelitarjottimen avoimien reunojen tiivistämiseen muotin luomiseksi. Kampan sijoittaminen geeliin luo kaivoja, joihin DNA on ladattu. Varmista, että kampa luo kaivon, joka on sopivan kokoinen DNA-näytteelle.
kaada sula agaroosi geelimuottiin ja anna sen kovettua huoneenlämmössä.
kun agaroosi on kovettunut, ota kampa pois. Jos geeliä ei käytetä välittömästi, kääri se muovikelmu ja säilytä 4ºC käyttöön asti.
Jos geeli on tarkoitus käyttää välittömästi, laita se geelirasiaan.,
tämän menettelyn aloittamiseksi lisätään erotettaviin DNA-näytteisiin geelilatausväriä. Latausväri tehdään tyypillisesti 6x-pitoisuudella. Lastaus väriaine auttaa visualisoida ja ladata näytettä kuoppiin ja auttaa määrittämään, kuinka paljon näytteissä on siirretty ajon aikana.
Aseta virtalähde haluttuun jännitteeseen.
Lisää nyt tarpeeksi juoksevaa puskuria geelirasiaan peittämään geelin pinnan. Varmista, että käytät samaa juoksupuskuria kuin geelin valmistuksessa käytetty puskuri.
Liitä geelirasian johtimet virtalähteeseen ja käynnistä se., Muista, että DNA on negatiivisesti varautunut ja siirtyy kohti anodi, joka on positiivinen, ja yleensä punainen väri. Varmista, ettei mustaa lyijyä tai katodia liitetä geelilaatikon pohjaan. Niin et unohda, pitää mielessä, että mustat kissat ovat huonoa onnea, tai negatiivinen, ja musta Katodi on siis negatiivinen. Aja geelisi punaiselle tai anodille. Tarkista, että molemmat geeli laatikko ja virtalähde toimii; ulkonäkö kuplia elektrodit osoittaa, että nykyinen kulkee sen läpi.
Poista geelirasian kansi., Lastaa DNA-näytteet hitaasti ja huolellisesti geeliin. Näytteen latausväri taas mahdollistaa näytteen uppoamisen geeliin ja auttaa seuraamaan, kuinka pitkälle näyte on kulkenut. Kokeellisten näytteiden mukana tulee aina lastata DNA: n kokomerkki eli tikapuut.
korvaa kansi. Tarkista kahdesti, että elektrodit on kytketty virtalähteen oikeisiin aukkoihin.
kytke virta päälle. Pyöritä geeliä, kunnes väriaine on siirtynyt sopivalle etäisyydelle.
kun elektroforeesiajo on suoritettu, sammuta virtalähde ja poista geelirasian kansi.,
Poista geeli geelilaatikosta ja valuta ylimääräinen puskuri geelin pinnalle. Aseta geelitarjotin talouspaperille, jotta jäljelle jäänyt juokseva puskuri imeytyy.
visualisoida DNA palasia, poistaa geeli geeli tarjottimelle ja paljastaa geeli ultra violetti valo.
DNA-fragmentin pitäisi näkyä oransseina fluoresoivina nauhoina. Ota kuva geelistä.
kokeen lopussa geeli ja juokseva puskuri on hävitettävä asianmukaisesti laitoskohtaisesti. Jälleen, muista aina käsitellä geeli ja käynnissä Puskurit käsineet välttää etidiumbromidi altistuminen.,
Nyt kun olet nähnyt, miten tehdä DNA-geeli elektroforeesi. Katsotaanpa katsomaan joitakin loppupään sovelluksia ja muunnelmia tämän erittäin hyödyllinen menetelmä.
tässä näet agaroosigeelielektroforeesituloksen PCR-tuotteiden erottamisen jälkeen. Geeliin ladatut DNA-sirpaleet näkyvät selkeästi määriteltyinä nauhoina. DNA: n vakio-tai tikkaat on erotettava toisistaan siinä määrin, että mahdollistaa hyödyllisiä määrittäminen koot näyte bändejä. Tässä esimerkissä 765 emäsparin, 880 emäsparin ja 1022 emäsparin DNA-sirpaleet erotetaan toisistaan 1.,5% agaroosigeeliä, jossa on 2 lokin DNA-tikkaat.
lisäksi vahvistaa läsnäolo DNA-fragmentti kiinnostaa, DNA-geeli elektroforeesi voidaan yhdistää geeli puhdistus menettelyjä. Tyypillisesti partakoneen terällä leikataan kiinnostava DNA-kappale pois, jotta se saadaan kerättyä ja sen sisältämä DNA-näyte talteen.,
Agaroosia geeli electrophesis voidaan myös yhdistää siirtää blotting, johon liittyy jolloin DNA: ta tai RNA: ta, siirtää selluloosa kalvo, jossa radioaktiivisten koettimet voidaan tunnistaa erityisiä DNA-tai RNA-sekvenssit teidän electrophoretically eroteltu näyte.
standard DNA-geelielektroforeesi ei ole ihanteellinen suurimolekyylipainoisen DNA: n erottamiseen yli 15-20 kb: n kokoiseksi, kuten genominen DNA. Erillinen suuri DNA-näytteitä, pulssi-field gel electrophoresis käytetään, joka liittyy alistamista geeli muuttuu, tai sykkivä, sähkökentän eri suuntiin., Tässä tekniikassa erikoistunut geeli käynnissä laite, joka on paria elektrodit puettu eri suuntauksia ympäri geeli. Tämä voidaan havaita eroja genomin koot välillä väestön organismien, kuten yhdistettyjä DNA-näytteitä eri mikrobien yhteisöjä, näet täällä, jotka on otettu eri järven ympäristöissä.
olet juuri nähnyt johdannon DNA-geelielektroforeesiin., Näytimme sinulle konsepti tapa, miten valmistautua agaroosi geeli, miten ladata näytteitä, miten käyttää geeliä, ja analysoida se ja joitakin yhteisiä sovelluksia agaroosia geeli elektroforeesi. Kiitos katselusta ja onnea geelin pyörittämiseen.