Keuhkojen arviointi. Keuhkojen toimintakokeet (PFT) tehtiin Brentwood Spirometrillä toimistossamme. Joillekin potilaille oli tehty testejä muualla.
Immuunitestaus. Testit tehtiin Immunosciences laboratorioissa tohtorin A. Wojdanin johdolla.. Kun otetaan huomioon näiden testien merkitys arvioinnin yhteydessä, menetelmää kuvataan yksityiskohtaisesti.,
Valmistelu formaldehydi-ihmisen seerumin albumiini (F-HSA) ja Formaldehydi -, naudan seerumin albumiini (F-BSA) konjugaatteja:
Elektroforeettinen ja immunoelectrophoretic vertailu HSA, BSA F-HSA-ja F-BSA suoritettiin määrittää konjugaatio esiintyminen. Konjugaatio oli osoituksena muuttaa liikkuvuutta F-HSA, F-BSA kun sitä verrattiin HSA-tai BSA vastaavasti. Lisäksi, määrä free amino lisää ryhmiä läsnä F-HSA-tai F-BSA määritettiin menetelmällä snyder ja Sobocinski (1975) ja sitä käytettiin arvioimaan määrä korvaaminen., Formaldehydiin sitoutuneita aminoryhmiä oli HSA: lla 26 ja BSA: lla 31. Tässä laskelmassa harkittiin intermolekulaarisen ristiyhteyden muodostamista.
Valmistelu tolueeni-di-isosyanaatti-ihmisen seerumin albumiini (TDI-HSA) ja Naudan seerumin albumiini (TDI-BSA) konjugaatteja:
Tämä valmistelu oli samanlainen menetelmiä Dewar ja Baur (1982). Mukaan tämän menetelmän, 1g HSA tai 1g BSA liuotettiin 100 ml: aan puskuriliuosta, joka sisältää kalium-kloridi (0.05 mol/l), natriumboraatti (0.05 mol/l), PH-9.4 ja jäähdytetään 4 C. Dioksaaniin (10 ml), jossa on 0.,15 ml tolueeni-di-isosyanaatti oli sitten lisätään tipoittain samalla sekoittaen aikana 3 tuntia, jonka jälkeen lisätään 2 ml etanoliamiinin, sentrifugointi, suodatus, dialyysi ja kylmäkuivaamalla. Samanlainen F-HSA-ja F-BSA, konjugaatio vahvisti elektroforeesi ja päättäväisyyttä vapaa-amino-ryhmien läsnä konjugaatti. Määrä amino-ryhmien pakko TDI oli 37 HSA ja 43 BSA. Lisäksi konjugaatin spektrografinen analyysi tehtiin Zeiss et: n mukaan. al. (1980)., Siellä oli selvästi lisääntynyt imeytyminen 230 260 nm, joka osoitti, että TDI oli tullut kovalenttisesti linkitetty proteiini harjoittaja. Tämä kasvu imeytymistä mieltä NH2-ryhmän määrittäminen vain 76 prosenttia HSA ja 81% BSA
Valmistelu trimellitic anhydride-ihmisen seerumin albumiini (TMA-HSA) ja Trimellitic anhydride naudan seerumin albumiini (TMA-BSA):
valmistella näiden konjugaattien 25 mg. TMA liuotettiin 0,5 ml: aan dioksaania ja lisättiin tipoittain joko 25 mg HSA-tai BSA liuotetaan 5 ml: aan kylmää 7% NaHCO3 veteen., Sekoittamisen jälkeen 60 minuuttia 4 C: n kohdalla konjugaatit dialysoitiin neljää 0,1 m NaHCO3: n muutosta ja yhtä puskurin muutosta vastaan. Lopuksi konjugaatit suodatettiin ja pidettiin -20 C: ssä, kunnes niitä käytettiin. TMA-HSA: n ja TMA-BSA: n OD-analyysit tehtiin vastaavaan kantajaproteiiniin liittyvien TMA-jäämien määrän määrittämiseksi. Pitoisuus-kantajaproteiiniin muutettiin molaarinen pitoisuus, jonka molekyylipaino on HSA-ja BSA. Suhde molaarinen pitoisuus TMA-ligandin ja proteiinin harjoittaja, suhde TMA jäämiä per molekyylejä harjoittaja oli laskettu., TMA-HSA arvioitiin sisältää 5 TMA jäämiä per HSA molekyylien ja TMA-BSA seitsemän jäämiä per albumiini molekyyli (Pien et al., 1988).
Valmistelu ftaalihappoanhydridi-ihmisen seerumin albumiini (PA-HSA) ja ftaalihappoanhydridi naudan seerumin albumiini (PA-BSA) konjugaatteja:
Nämä hapteenia-konjugaatteja valmistettiin lisäämällä 75 mg PA jäähtynyt liuos 300 mg HSA-tai BSA 100 ml H2O. Reaktio seosta sekoitettiin yön yli, dialyzed vastaan 0,1 M PBS käyttäen tubingit cutoff 8000 dalton. Käyttäen menetelmää Zeiss et. al. (1977) molaarisuhteet laskettiin., Moolisuhteet olivat PA/HSA: n osalta 22/28 ja PA/BSA: n osalta 25/30.
Valmistelu bentseeni rengas HSA (B-HSA) ja Bentseeni rengas BSA (B-BSA) konjugaatteja:
nämä valmisteet, 40 mg. P-aminobentsoehappoa liuotettiin 2 ml: aan 1 n HCL: ää ja jäähdytettiin upottamalla jääkylpyyn. Kylmäliuos 14 mg/ml lisättiin pisaroittain. Jokaisen lisäyksen jälkeen seosta sekoitettiin 30 sekuntia. Samanaikaisesti, yksi gramma HSA-tai BSA liuotettiin boorihappoa 0.16 M natriumkloridi (0-15 M) buffer PH 9.0 (PH nostettiin NaOH)., Albumiinien liuoksia sisältävät dekantterilasit ympäröitiin jääkylvyllä magneettisekoittimella. Diatsoniumsuolaliuos lisättiin pisaroittain sekoittaen nopeasti kylmään proteiiniliuokseen. Jokaisen pisaran lisäämisen jälkeen PH palautuu arvoon 9,0-9,5 yhdellä normaalilla NaOH: lla. Kun kaikki liuos on lisätty, reaktio oli mahdollisuus jatkaa hitaasti sekoittaen vähintään tunti, jossa lisäysten ja NaOH-liuosta ja ylläpitää PH-alue 9,0 9,5., Reagoimattoman pieniä molekyylejä poistettiin laajoja dialyysi tai läpikulun sarakkeen sephadex G-25 kylmässä huoneessa, jossa on isotoninen suolaliuos, kuten päällystetty puskuri. B-HSA: n ja B-BSA: n oranssin värin kehityksen OD-analyysit tehtiin vastaavaan kantajaproteiiniin liittyvien B-jäämien määrän määrittämiseksi. HSA: n B-substituutioita oli noin 41 ja BSA: n 53 (Migrdichian, 1957).
Vasta-aineiden Määritys:
Erityisiä vasta-aineita vastaan F-HSA, TDI-HSA -, TMA-HSA, PA-HSA-ja B-HSA analysoitiin, jonka progressiivinen ELISA-määritys., Kaivot mikrotiitterilevyjen (Dynatech, Alexandria, VA) olivat päällystetty 100 1 antigeenin ratkaisuja (100 g/ml) 0,1 M PBS PH 7.2 yön yli 4 C: Levyt pestiin 4 kertaa 0,1 M PBS, joka sisältää 0.05% tween 20 kunkin vaiheen välillä. Ilmainen imeytymistä sivustot olivat tukossa 2% proteaasi-ilmainen naudan seerumin albumiini huoneenlämmössä 4 tuntia ja säilytettiin -20 C: ssa, kunnes käytetään.,
Analyyttinen Menettely:
– menettely sisältyvät seuraavat: (1) pesu-neljä kertaa, (2) lisäksi 100 1 laimennetun seerumin (1:2 IgE: n ja 1:100 IgM ja IgG) vuonna PBS-tween-20, jossa 1% BSA (3) inkubointi 4 tuntia 20 C, jonka jälkeen pesu 4 kertaa, (4) lisäksi 100 1 optimaalinen laimennus alkalisen fosfataasin merkitty affiniteetti puhdistettu goat anti-ihmisen IgE: ( ) (1:200), IgM (1:500) ja anti-IgG (1:1000), ostettu KPI (Maryland) (5) inkuboinnin 120 minuuttia 20 C, (6) pesu 6 kertaa, (7) lisäksi 100 1 P-nitrofenyyli-fosfaatti (Sigma Chemical Co.,) (8) inkubointi 60 minuuttia 20 C (9) lisäksi 50 1 3 N natriumhydroksidiliuosta, ja (10) kappaleena käsittelyssä. Tulokset laskettiin mikrotieterinlukijan avulla 405 nm: n kaksoiskappaleiden absorbanssien perusteella. Kaikki näytteet luettiin HSA-antigeenia vastaan kontrollina, joka ei ollut spesifinen F-HSA: lle, TDI-HSA: lle, TMA-HSA: lle, PA-HSA: lle ja B-HSA: lle. Tulokset ilmaistiin titterinä. Titteri on seerumin viimeinen laimennos, joka antaa absorbanssin kaksi kertaa HSA-kontrollia.,
Spesifisyys Ja Cross-Esto Tutkimukset:
määrittämiseksi vasta-aineiden spesifisyys cross-esto tutkimus oli toteutettu. Positiivinen sera kunkin hapteenia-proteiini konjugaatti ajettiin sen jälkeen, kun asianmukaiset inkuboinnin ja sademäärä kanssa kymmenkertaiseksi lisätä välein hapteenia sidottu HSA-tai BSA-estäjät kuten kattamaan erilaisia vasta-aineen antigeenin liikaa. Tämä vaihteluväli oli hapten-BSA: n osalta 50-1000 g ja hapten-RSA: n osalta 80-1000 g., Inkubaation jälkeen 37 C ja poistaminen sakka sentrifugoimalla näytteitä ennen ja jälkeen cross-esto tutkimuksessa olivat sitten laitetaan levyt kaivot on päällystetty erityinen konjugaatti. Seuraavia vaiheita seurattiin edellä kuvatulla tavalla ELISA-tutkimuksessa.
IgG-ja IgM-vasta-aineiden sitoutumisen eri konjugaattien oli estää hapteenia-HSA tai hapteenia-BSA 36-85%. Tietyllä pitoisuus, sekä hapteenia-HSA-ja hapteenia-BSA-estää vasta-aineiden taso vastaavia tapoja.,
Osittainen estyminen IgE-vasta-aineen sitova eri hapteenia konjugaattien havaittiin, kun seerumin oli esi-inkuboidaan kanssa hapteenia-HSA tai hapteenia-BSA. Tämä IgE-vasta-aineen eston puutteellinen havainnointi liittyi pääasiassa siihen, ettei laboratoriossamme ollut seerumia, jossa IgE-titterit olivat korkeita eri kemikaaleja vastaan.,
Määrittäminen Normaali Vasta-ainetaso (Valvonta):
edellä esitetyn Perusteella menettelyt, 160 veren luovuttajan näytteitä terveitä henkilöitä, molemmat sukupuolet, iältään 22-55, tutkittiin vasta-ainetasot vastaan F-HSA, TD-HSA -, TMA-HSA, PA-HSA -, ja B-HSA. IgG:n keskimääräinen titteri oli 1:800 400, IgM:n 1: 3200 1600 ja IgE: n 1: 8 4. Niinpä meidän laboratorio tiitterit suurempi kuin 1:1600 IgG, 1:6400 varten IgM ja 1:16 IgE pidetään positiivinen.,
tietyllä potilaalla vasta-ainetittereiden nousua tai putoamista useammalla kuin yhdellä laimennuksella pidettiin merkittävänä (KS.taulukot).
– Lymfosyyttien Alaryhmä Luettelointi:
yhden laser virtauksen cytometer (Eepokset Profiili: Coulter Eepokset, Inc., Hialeah, FL), joka syrjii eteen-ja kulmassa Valon hajonta, sekä kaksi väriä, käytettiin ohjelmistopaketti (Quad Stat: Coulter). Mononukleaaristen solujen populaatioita määritettiin kaksi-väri immunofluoresenssitutkimuksessa käyttämällä koko veren värjäys tekniikka asianmukaiset monoklonaalinen vasta-aine ja virtaussytometria (Fletcher et al.,, 1989) seuraavat paria fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) tai phycoerythrin (PE)-konjugoitu monoklonaalisia vasta-aineita (Coulter immunologia) valittiin: T11-TKI – /B4-FITC -, T4-TKI – /T8-FITC -, T3-FITC/NKH-1-TKI-ja T11-FITC/Tal-PE määrittämiseen T-solu/B-solu T-auttaja/T-vaimennin, NKHT3+ /NKHY3 ja vaihtoehtoinen reitti lymfosyyttien aktivointi vastaavasti.
seurata, lymfosyyttien markkereita, bat kartat olivat käytössä lymfosyyttien väestöstä eteenpäin-kulma valon hajaantuminen vs. 90 valon hajaantuminen on histogrammi., Kunkin merkkiparin positiivisesti värjäytyneiden solujen prosenttiosuus sekä tuplasti värjättyjen solujen prosenttiosuus määritettiin. Arvioiden mukaan absoluuttinen määrä lymfosyyttien positiivinen kummankin pinnan markkereita määritettiin kertomalla reuna-lymfosyytti-solujen määrä on prosenttiosuus positiivisesti värjätään solut jokaiselle merkki pari. Myös kaksin verroin värjättyjen solujen prosenttiosuus määritettiin., Arvioiden mukaan absoluuttinen määrä lymfosyyttien positiivinen kummankin pinnan markkereita määritettiin kertomalla perifeeristen lymfosyyttien solujen määrä, jonka osuus positiivisia soluja, kunkin pinta-merkki.
Mittaus anti-myeliinin perus-proteiinin vasta-aineita:
Ihmisen myeliinin perus proteiinia (HMBP) oli valmis menetelmällä Diebler et al. (1972) ja tarkastettu puhtaus polyakryyliamiinigeelielektroforeesilla. Antiseerumin HMBP aiheutettiin kaneilla toistuva injektio HMBP täysin Freund adjuvantti on., Vasta-aineiden toimintaa kani sera ja potilaan näytteet oli havaita lisäämällä eri laimennoksilla (1:100 1:10 000) sera wells on mikrotiitterilevyn levy on aiemmin päällystetty HMBP seuraavasti: HMBP 250 g/ml, oli liuennut karbonaatti-puskuri, PH 9,6 ja 200 litraa tätä liuosta lisättiin kuhunkin kuoppaan. Haudonnan, pesun ja eston jälkeen kaivoihin lisättiin 200 1 joko laimennettua kanin tai ihmisen seerumia. Kun seerumia oli haudottu tunnin ajan 37 C: n lämpötilassa, se ravistettiin ulos kaivoista, minkä jälkeen se pestiin 5 kertaa pesuliuoksella., 200 1 peroksidaasi-konjugoitua vuohen anti-kani tai vuohen anti ihmisen IgG, IgM tai IgA (optimaalinen laimennus) lisättiin sopivaan hyvin. Haudonnan ja toistuvan pesun jälkeen jokaiseen kaivoon lisättiin 200 1 ABTS-alustaa. Lautasia inkuboitiin tunnin ajan huoneenlämmössä ja ne luettiin mikrotieterilukulaitteessa 405 tun aallonpituudella. Käyttäen kanin antiseerumia; titrauskäyrä piirrettiin ja potilaan seerumia verrattiin tähän standardikäyrään., Perustuu yli 200 valvontaa ja potilaiden näyte määrityksiä, litraa suurempi kuin 1:2000 IgA, 1:5000 IgM, ja 1:8000 sillä IgG katsottiin olevan positiivinen.