Mikä on Virtaussytometria (FACS-analyysi)?

alun Perin kehitetty 1960-luvun lopulla, virtaussytometria on suosittu analyyttinen solu-biologian tekniikka, joka hyödyntää valon määrä ja profiili solujen erilaisten nesteen seos. Virtaussytometria on erityisen tehokas menetelmä, koska sen avulla tutkija, nopeasti, tarkasti ja yksinkertaisesti kerätä tietoja, jotka liittyvät monia parametreja heterogeeninen nesteen seos, joka sisältää eläviä soluja.,

virtaussytometria on käytetty laajasti koko elämän-ja biomedical sciences, ja sitä voidaan soveltaa missä tahansa tilanteessa, jossa tutkija on nopeasti profiilin suuri väestö löysä solujen neste media. Esimerkiksi immunologian virtaussytometria on tunnistaa, erottaa ja kuvata eri immuunijärjestelmän solujen alatyypit nojalla niiden koko ja morfologia.

Kun lisätietoja tarvitaan, vasta merkitty fluoresoivia väriaineita, ja nosti vastaan erittäin spesifisiä solun pinta-antigeenejä (esim., klustereita eriyttäminen tai CD-markkereita) voidaan paremmin tunnistaa ja erottaa erityisillä alaryhmillä sisällä suurempi ryhmä.

Virtaussytometrissä

• Näytesolut kulkevat kapean kanavan läpi yksi kerrallaan.
• valoa käytetään kanavan solujen valaisemiseen.
• joukko sensoreita havaitsee soluista taittuvan tai säteilevän valon tyypit.
• antureiden hankkima Data kootaan ja integroidaan, jotta näytteestä saadaan kattava kuva.,

FACS Vasta-aineita, joita käytetään tällä hetkellä Tutkimus

Erilaisia Valo käyttää virtaussytometria Kokeilu

virtaussytometri käyttää taittuu tai valoon laskea ja tunnistaa soluja. Tutustu erityyppisiin Valoihin, joita käytetään virtaussytometriakokeessa seuraavissa luvuissa.,

Eteenpäin Scatter

Eteenpäin hajallaan valo taittuu solu flow-kanava ja jatkuu pitkin valo polku (eli samaan suuntaan, että valo oli alun perin matkalla). Etummainen hajavalo havaitaan valopolun anturilla, ja sitä käytetään tyypillisesti hiukkaskoon tunnistamiseen.

eteenpäin hajavaloa käytetään yleisimmin kohteen koon havaitsemiseen valopolulla., Suurempia esineitä tuottaa enemmän eteenpäin hajallaan valoa kuin pienempiä esineitä, ja suurempia soluja on vahvempi eteenpäin scatter-signaalin

Side Scatter

Puolella hajallaan valo kulkee valaistus lähde virtaa kanava, taittuu solujen suuntaan, että on, ulkopuolella alkuperäinen valo polku. Sivuvalo havaitaan anturilla, joka on kohtisuorassa alkuperäiseen valopolkuun nähden.,

Side-hajavalo on yleensä tapana tehdä päätöstä koskevat rakeisuus ja monimutkaisuus solun valo polku. Erittäin rakeinen soluja, joilla on suuri määrä sisäistä monimutkaisuutta, kuten neutrofiilit, tuottaa enemmän puoli-hajallaan valoa, ja suurempi puolella-scatter signaali kuin soluja, joilla on alhainen rakeisuus ja monimutkaisuus.

Fluoresenssi Emissio

Loisteputki valo emittoituu fluoresoivia molekyylejä jälkeen heräte, jonka yhteensopiva laser aallonpituus., Loisteputki voi olla peräisin luonnostaan fluoresoivia materiaaleja solun, tai voivat olla peräisin fluoresoivia väriaineita tai fluoresenssi-merkittyjä vasta-aineita, joita on käytetty etiketti erityinen rakenne, solun.

Multiparametric Analyysi

pilkata virtaussytometria dot-plot, piirtämistä eteenpäin vs puolella-hajallaan väestö, leukosyytit., Solupopulaatioille on ominaista niiden todennäköinen identiteetti:

d oletetut roskat, hyvin pienet kohteet, joilla on alhainen etu – ja sivujakautuma.

L/M todennäköiset leukosyytit/monosyytit, pienet tai keskisuuret solut, joilla on alhainen sisäinen monimutkaisuus / rakeisuus. Nämä solut tuottavat keskipitkällä forward-scatter ja low side-scatter-signaalin voimakkuus

G Todennäköistä, granulosyyttien, suuria soluja, joilla on korkea sisäinen monimutkaisuus/rakeisuus. Nämä solut tuottavat suuria etu-ja sivujakautuvia signaaleja.,

Vaikka jotkut identiteettiä voidaan vahvistaa eteenpäin ja puoli-scatter-profiilit, merkintöjä solu-tyyppi erityinen merkki tarjoaa aina suurempi tarkkuus ja varmuus, kun profilointi monimutkainen heterogeeninen väestö soluja.

esimerkiksi, juoni edellä, tutkija voi erottaa toisistaan granulosyyttien ja lymfosyyttien käyttämällä eteen-ja puoli-hajallaan valo. Kuitenkin kolme luokkaa granulosyyttien (neutrofiilit, basofiilit ja eosinofiilit) ovat hyvin samankaltaisia koko ja rakenne, antaa heille samanlainen valon sironnan ominaisuuksia., Tässä tapauksessa neutrofiilit voitaisiin selektiivisesti merkitä niiden ilmentymisen perusteella neutrofiilien ominaismarkkeriksi, kuten ELANE.

FACS: Lajittelu Solut perustuu virtaussytometria Tiedot

ehdot virtaussytometria ja fluoresenssi-aktivoida solun lajittelu (FACS) käytetään usein synonyymeinä. Käytännössä näiden kahden menetelmän välillä on eroja.

FACS on johdannainen virtaussytometria, joka lisää poikkeuksellisen paljon toiminnallisuutta. Faksien avulla tutkija voi fyysisesti lajitella heterogeenisen soluseoksen eri populaatioihin.,

käyttämällä erittäin spesifisiä vasta merkitty fluoresoivia väriaineita, tutkija voi suorittaa FACS-analyysi ja samanaikaisesti kerätä tietoja, ja jonkinlainen näyte jonka lähes rajaton määrä erilaisia parametreja.

Vuonna FACS Kokeilu:

• Forward-scatter -, sivu-scatter, ja loisteputki tiedot on kerätty, kuten perinteisissä virtaussytometria.
• käyttäjän määrittelemät parametrit antavat tietoa siitä, miten solut on lajiteltava.
• näiden parametrien perusteella FACS-kone käyttää elektrodia, jolla kullekin solulle asetetaan sähkövaraus.,
• poistuttaessa virtaus jaosto, sähkömagneetit lajitella soluja veloituksetta erillisiin astioihin.

miltä Flow-Sytometrian tiedot näyttävät?

virtaussytometriakokeessa jokainen solu, joka kulkee virtaussytometrin läpi ja havaitaan, luokitellaan erilliseksi tapahtumaksi.

Lisäksi, kunkin valoa, että on havaita virtauksen cytometer (forward-scatter -, sivu-scatter, ja jokainen aallonpituus fluoresenssin emission) osoitetaan oma ainutlaatuinen kanava., Virtaussytometrian tiedot kuvaavat jokaista tapahtumaa itsenäisesti ja edustavat jokaisessa kanavassa havaitun valon signaalin voimakkuutta jokaista tapahtumaa varten.

virtaussytometria tiedot on tyypillisesti edustettuna kahdella tavalla: histogrammit, joka mitata tai vertailla vain yksi parametri, ja piste-tontteja, joka vertaa 2 tai 3 parametrit samanaikaisesti kaksi – tai kolmiulotteinen scatter-tontti.

histogrammin tyypillisesti tontteja intensiteetti havaita yhden kanavan mukaan yksi akseli ja tapahtumien määrä osoittaa, että intensiteetti on erillinen akseli., Suuri määrä tapahtumia havaita tietyssä intensiteetti näkyy piikki histogrammi.

sen sijaan piste-tontilla jokainen tapahtuma esitetään yhtenä pisteenä hajontajännitteellä. Intensiteetti 2 eri kanavaa (tai 3 eri kanavia kolmen dimensnal juoni) ovat edustettuina sekä eri akseleilla. Tapahtumat, joilla on samanlaisia intensiteettejä, ryhmittyvät samalle alueelle scatter-tontilla.

Histogrammit-ja piste-tontteja sekä tarjota erilaisia etuja virtaussytometria data-analyysi. Valitsemalla, miten parhaiten edustat tietojasi, voit varmistaa, että se kertoo täydellisen tarinan yksinkertaisessa, ymmärrettävässä muodossa.

Piste-tontteja ja histogrammit eivät ole toisiaan poissulkevia, ja kaikkein monimutkainen virtaussytometria kokeiluja, hyödyntävät useita tontteja näyttää rikas, multi-parametrinen tiedot perustuvat otokseen.

monissa tapauksissa useampi kuin kolme muuttujaa on piirrettävä samanaikaisesti., Tässä tapauksessa, data-analyysi tekniikka, joka tunnetaan nimellä gating voi auttaa antaa lisää tarkkuus ja joustavuus, jolloin analyysi on lähes rajaton määrä muuttujia samanaikaisesti useilla eri scatter-tontteja ja histogrammit.

Gating lisää Päätöslauselman virtaussytometria Tiedot

lyhyesti sanottuna, gating on menetelmä valitsemalla solut virtaussytometria kokeilu, jota haluat analysoida tarkemmin yksityiskohtiin., Gating avulla tutkija kerää ja näyttää enemmän tietoja tekemät solujen kuin voisi yleensä olla esillä 2 – tai 3-ulotteinen piste-tontti.

Gating lisää päätöslauselman virtaussytometria kokeilla, ja mahdollistaa samanaikainen analyysi on lähes rajaton määrä eri parametreja (kanavat).

aidatulla virtaussytometria Kokeilu:

• käyttäjä kerää virtaussytometria tietoja yhden tai useamman kanavan piste-tontti.
• tietojen Perusteella hankittu, käyttäjä vetää gate-ruutuun valitsemalla tekemät solujen tarkempaa analysointia.,
• tekemät solujen sisällä portti on erityisesti korostettu muiden tonttien näyttää tietoja vaihtoehtoisia kanavia.

Gates lisää uskomaton määrä joustavuutta virtaussytometria, myönnetään enintään yhden solun tarkkuus jokaisen kanavan käytettävissä tutkija. Useita portteja voidaan perustaa yhden scatter-juoni, ja portit voidaan ”pinota” ja yhdistetty (eli tekemät solujen aidatulla kanavien 1 ja 2 voidaan edelleen aidatulla kanavien 3 ja 4, jotta enemmän spesifisyys ja syvempi analyysi).,

esimerkki gating

huomautus Korvausta

Heijastusvaikutuksia yksi kanava toiseen voi aiheuttaa virheellisesti positiiviseksi havaittuja signaaleja. Heijastusvaikutuksia on artefactual signaalin, että yksi fluoresoiva väriaine voi aiheuttaa kanavan toisen fluorophore funktiona sen suhteellinen kirkkaus ja päästöjen taajuuksien. Tässä on kyse korvauksista. Kompensaatio on menettely, joka eristää signaalin yhdestä tietystä kanavasta muista samassa kokeessa käytetyistä kanavista. FITC esim., sen päästöhuippu on sähkömagneettisen spektrin vihreällä alueella. Se kuitenkin fluoresoituu myös keltaisessa kanavassa, jossa PE säteilee valoa. Yksinkertaisesti sanottuna kompensaatio vähentää FITC-signaalia PE-kanavalta.

tämä signaali ”väärällä” kanavalla vähennetään kiinnostavan fluoroforin aiheuttamasta signaalista. Yllä olevassa näytteessä vihreän ja keltaisen komponentin suhde tietyllä heräteaallonpituudella on FITC: lle vakio., Näin on mahdollista päätellä, määrä epäspesifinen keltainen FITC signaalin PE kanavan mittaus vihreä kanava käyttämällä jatkuva korvaus-kertoimet. Sama pätee PE: stä FITC-kanavalle lähtevään vuotoon.