SDS-PAGE (sodium dodecyl sulphate-polyakryyliamidia gel electrophoresis) käytetään yleisesti laboratoriossa erottaminen proteiineja perustuu niiden molekyylipaino. Se on yksi niistä tekniikoista, joita käytetään yleisesti, mutta ei usein täysin ymmärretty. Yritetään korjata se.
SDS-PAGE erottelee proteiinit niiden molekyylipaino, joka perustuu niiden erisuuruisten migration läpi seulonnan matriisi (geeli) vaikutuksen alaisena on sovellettu sähkö-kenttään.,
mikä määrä Proteiinia Migration Verrannollinen Molekyylipaino
liikkeen kaikki ladattu lajien kautta sähkökentän määräytyy sen net maksu, sen molekyylien säde ja suuruus soveltaa alalla. Naiivisti taitettujen proteiinien ongelma on kuitenkin se, että niiden nettovaraus tai molekyylisäde eivät ole molekyylipainosta riippuvaisia. Sen sijaan niiden net maksu määräytyy aminohappo koostumus eli summa positiivisten ja negatiivisten aminohappoja proteiinia ja molekyylien säde, jonka proteiini on korkea-asteen rakenne.,
Joten niiden alkuperäisessä tilassa, erilaisia proteiineja, joilla on sama molekyyli paino olisi siirtää eri nopeuksilla sähkökentän riippuen niiden maksu-ja 3D-muoto.
erottaa proteiinit on sähköinen kenttä, joka perustuu niiden molekyylipaino on vain, meidän täytyy tuhota asteen rakenne vähentämällä proteiinin lineaarinen molekyyli, ja jotenkin peittää luontainen net maksu proteiinia. SDS tulee sinne.,
Rooli SDS (et al)
SDS on pesuainetta, joka on läsnä SDS-PAGE-näyte puskuri jossa yhdessä hieman kiehuvaa, ja pelkistävän aineen (tavallisesti DTT-tai B-MINUA hajottaa proteiini-proteiini-disulphide joukkolainat), se häiritsee korkea-asteen rakenne proteiineja. Tämä tuo Taitetut proteiinit lineaarisiin molekyyleihin.
SDS myös takit proteiinin kanssa yhtenäinen negatiivinen varaus, joka peittää sisäisiä maksuja R-ryhmät. SDS sitoutuu melko tasaisesti lineaarisiin proteiineihin (noin 1.,4g SDS / 1g-proteiini), eli proteiinin varaus on nyt suunnilleen verrannollinen sen molekyylipainoon.
SDS on myös läsnä geeli varmistaa, että kun proteiinit ovat linearisoidaan ja niiden maksuja naamioitu, että he pysyvät sillä tavalla kaikkialla ajaa.
määräävä tekijä SDS-pinnoitetun proteiinin määrittämisessä on sen molekyylisäde., SDS-pinnoitettu proteiineilla on osoitettu olevan lineaarinen molekyylejä, 18 Ä leveä ja pituus suhteessa niiden molekyylipaino, joten molekyylien säde (ja siten niiden liikkuvuutta geeli) määräytyy molekyylipainon proteiini. Koska SDS-pinnoitettu proteiinien varaus on sama massa-suhde, ei ole mitään ero muuttoliike perustuu vastaa.
Geeli Matriisi
on sovellettu sähkö-kenttä, SDS-käsitelty proteiinien nyt siirtyä kohti positiivinen anodi eri hinnat riippuen niiden molekyylipaino., Näitä erilaisia liikeratoja liioitellaan geelimatriisin suuren kitkan vuoksi.
Kuten nimestä voi päätellä, geeli matriisi, jota käytetään SDS-PAGE on polyakryyliamidia, joka on hyvä valinta, koska se on kemiallisesti inertti ja, mikä tärkeintä, voi helposti olla tehty eri pitoisuudet tuottaa eri huokosten koot antaa erilaisia erottaa ehtoja, jotka voidaan muuttaa riippuen tarpeisiin. Saatat muistaa, että kirjoitin aiemmin artikkelin akryyliamidipolymeroinnin mekanismista.,
Epäjatkuva Puskuri Järjestelmän ja Pinoaminen Geeli – Vuori Niitä lähtöviivalla
suorittaa nykyinen katodi (negatiivinen) ja anodi (positiivinen) kautta geeli, puskuri on selvää, että tarvitaan. Useimmiten käytämme epäjatkuvaa Laemmli-puskurijärjestelmää. ”Epäjatkuva” tarkoittaa yksinkertaisesti sitä, että geelin ja säiliön puskuri on erilainen.
Yleensä, järjestelmä on perustettu pinoaminen geeli, jonka pH on 6.8, puskuroitu, jonka Tris-HCl, käynnissä geeli puskuroitu pH 8.8 mukaan Tris-HCl-ja elektrodi buffer pH 8.3., Pinoamisgeelillä on alhainen akryyliamidipitoisuus ja juoksevalla geelillä suurempi pitoisuus, joka pystyy hidastamaan proteiinien liikettä.
Niin, mikä on kaikki nämä eri pH on?
No, glysiini, voi olla olemassa kolme eri maksua valtioille, positiivinen, neutraali tai negatiivinen, riippuen pH. Tämä on esitetty alla olevassa kaaviossa. Valvonnasta vastaa valtion glysiini eri puskureita on avain koko pinoaminen geeli asia.,
tässä on, miten pinoaminen geeli toimii. Kun virta on päällä, negatiivisesti varautuneet glysiini-ioneja pH 8.3 elektrodi puskuri on pakko tulla pinoaminen geeli, jossa pH on 6,8. Tässä ympäristössä glysiini siirtyy pääasiassa zwitterioniseen (neutraalisti varattuun) tilaan. Tämä latauksen menetys aiheuttaa sen, että ne liikkuvat hyvin hitaasti sähkökentässä.
Cl – ioneja (alkaen Tris-HCl) toisaalta, liikkua paljon nopeammin sähkökenttä ja ne muodostavat ioni edessä, että siirtyy eteenpäin glysiini., Erottaminen Cl – alkaen Tris counter-ioni (joka on nyt siirtymässä kohti anodi) luo kapea vyöhyke, jossa on jyrkkä jännitteen kaltevuus, joka vetää glysiini sekä sen takana, tuloksena on kaksi suppeasti erotettu rintamilla siirtyvät ionit; erittäin mobiili Cl – edessä, jonka jälkeen hitaammin, enimmäkseen neutraali glysiini edessä.,
Kaikki proteiinit geeliä näyte on elektroforeettinen liikkuvuus, joka on välimuoto äärimmäistä liikkuvuutta glysiini ja Cl-, niin kun kahdella rintamalla lakaista läpi näyte no, proteiinit ovat keskittyneet kapeaan vyöhykkeeseen välillä, Cl – ja glysiini rintamilla.
And They ’ re Off!
Tämä kulkue jatkuu, kunnes se osuu käynnissä geeli, jossa pH siirtyy 8.8. Tässä pH: ssa glysiinimolekyylit ovat enimmäkseen negatiivisesti varautuneita ja voivat siirtyä paljon nopeammin kuin proteiinit., Glysiinirintama siis kiihtyy proteiinien ohi, jolloin ne jäävät pölyyn.
tuloksena on, että proteiinit ovat jätetty hyvin kapea rajapinnassa pinoaminen ja käynnissä geelit ja koska käynnissä geeli on lisääntynyt akryyliamidin pitoisuus, joka hidastaa liikkumista proteiinit niiden koon mukaan, erottaminen alkaa.
mistä oli kyse?
Jos vielä ihmettelet, miksi pinoamisgeeliä tarvitaan, mieti, mitä tapahtuisi, jos et käyttäisi sitä.,
Geelikaivot ovat noin 1cm syvyydessä, ja ne on yleensä täytettävä huomattavasti, jotta geeliin saadaan riittävästi proteiinia. Joten ilman pinoamisgeeliä näytteesi istuisi juoksevan geelin päällä jopa 1cm syvänä kaistana.
sen Sijaan, että rivissä yhdessä ja lyömällä käynnissä geeli yhdessä, tämä tarkoittaisi, että proteiineja näyte olisi kaikki tulevat käynnissä geeli eri aikoina, jolloin hyvin sotkee bändejä.,
Joten pinoaminen geeli varmistaa, että kaikki proteiinit saapua käynnissä geeli samaan aikaan, joten proteiineja saman molekyylipaino siirtyvät tiukka bändejä.
Erottaminen
Kun proteiinit ovat käynnissä geeli, ne on erotettu toisistaan, koska korkeamman molekyylipainon proteiinit liikkuvat hitaammin läpi huokoisen akryyliamidi geeli kuin alhaisemman molekyylipainon proteiineja. Koko huokoset geeli voidaan muuttaa riippuen koosta proteiineja haluat erottaa muuttamalla akryyliamidin pitoisuus. Tyypilliset arvot on esitetty alla.,
laajempaa erottaminen alue, tai proteiineja, jotka ovat vaikea erottaa, kaltevuus geeli, joka on kerroksia lisäämällä akryyliamidin pitoisuus, voidaan käyttää.