UDG-välitteisen urasiili poisto-ja kemiallinen AP-sivuston tissivakoani microarray
DNA strand pilkkominen välittyy UDG koostuu kaksi erillistä vaihetta: excision urasiili pohjan, jonka jälkeen pilkkominen tuloksena perustoimitukset-sivusto. Näitä kahta vaihetta voidaan seurata erikseen DNA-mikrojärjestelmissä., Ensimmäinen, perustoimitukset sivustot ovat luotu käsittelemällä array UDG ja toisessa vaiheessa, strand pilkkominen saa aikaan altistamalla pinta-kytkettynä, DNA-oligonukleotidit, jotka sisältävät koskee sivustoja, joko happamia tai emäksisiä olosuhteissa, tai haihduttamalla pinnan kuivumista. Tällaisia kemiallisia strategioita cleave perustoimitukset sivustoja DNA-säikeet poistaa tarvetta lisää entsymaattinen pilkkominen ja mahdollistaa UDG kinetiikkaa on tutkittu riippumattomasti., Tätä varten paneelit 30mer DNA-sekvenssien kanssa kasvava määrä ei-peräkkäisiä dU-yhteisöiltä (dU1 – dU9) oli suunnitella ja syntetisoida maskless nukleiinihapon fotolitografia, käyttäen vastaavaa valoherkkä dU phosphoramidite (Fig. 2). Jokainen DNA-säie oli syntetisoitu kanssa dT15-linkkerin lasin pintaan ja päättyy klo 5′-pää 25mer kohde sekvenssi hybridisaatio (QC25), kuten on osoitettu Kuvassa. 3.,
Molecular structure of the 5′-NPPOC deoxyuridine 3′-phosphoramidite (in the text referred to as dU or uracil nucleotide.
(A) Sequence design for the investigation of uracil and abasic site cleavage on microarrays., Kukin jakso koostuu dT15-ristisilloittaja polyakryyliamidigeelien valmisteluun, sitten 30mer joko ei dUs – (valvonta -) tai yhä useammat dU-yhteisöiltä (1-9), joka korvaa dTs seuraavassa järjestyksessä: 5′-TTA-CCA TAG AAT KISSA GTG CCA TAC ATC ATC-3′. 5′-pää, ohjaus 25mer on syntetisoitu (QC25), toimii tavoite hybridisaatio sen 3′-Cy3-merkitty täydentäviä oligonukleotidi (QC25c). Pilkkominen prosessi oli seurata tallennus hybridisaatio-perustuu fluoresenssi-intensiteettiä ennen ja jälkeen UDG-välitteisen pilkkominen urasiili nukleotidit. B) pieni ote (n., 7% kokonaissynteesialueesta) fluoresenssikuvauksista ennen entsyymialtistusta ja sen jälkeen. Skannaa näyttää fluoresenssin intensiteetti, jotka johtuvat hybridisaatio on merkitty, täydentäviä oligonukleotidi. Mikrorakenteet skannattiin 5 µm: n tarkkuudella. (C) Lasku fluoresenssi-intensiteetti UDG-välitteisen urasiili leikkaaminen (siis tuottaa perustoimitukset sivustoja) funktiona määrä dU nukleotidin yhtiöittämisten per DNA: n substraatti. Todellinen pilkkoutumistehokkuus korreloi DNA-substraatin pilkkoutumisesta johtuvan fluoresenssivoimakkuuden häviämisen kanssa., Array inkuboitiin yksi tunti UDG ja syntyy perustoimitukset sivustot olivat myöhemmin halkaistut emäksisissä olosuhteissa. Fluoresenssin voimakkuuden väheneminen kirjattiin ja normalisoitiin kontrollilohkoon (U0). Mielivaltaisissa yksiköissä ilmoitetut normalisoidut intensiteetit piirrettiin DNA: n substraattia kohti mitatun dUs-arvon päälle. Virhepalkit ovat SD.
sijainti kaikki koettimen sekvenssit yhdessä vastaavat kopioi ja valvonta-säikeet kuljettavat dT sijaan dU nukleotidien oli satunnaistettu koko microarray pinta., Ennen entsymaattinen käsittely, DNA-koettimen sekvenssit olivat hybridisoitiin, että Cy3-merkitty täydentäviä 25mer oligonukleotidi (QC25c) jotta voidaan määrittää alkuperäisen fluoresenssi-intensiteetin arvoja. 3 ’ – Cy3-merkintää käytettiin estämään mahdollisia fluoresenssiesineitä väriaineen ja dUs46: n vaihtelevan määrän yhteisvaikutusten vuoksi. Että mikrosiruja oli sitten altistuvat kaupallisesti tuotettua UDG E. coli ja perustoimitukset sivuston pilkkominen oli tämän jälkeen suoritetaan eri olosuhteissa. Optimaalinen entsyymialtistus-aika määritettiin alkukokeissa. Tuloksemme (Kuva., S1) osoittavat, että jälkeen lisäämällä entsyymi, pilkkominen tehokkuus kasvaa merkittävästi ajan myötä, jopa tunnin, saavuttaa hyötysuhde on noin 50-60%, vain hieman muutoksia, kun edelleen altistuminen UDG. Näin asetamme optimaalisen altistusajan yhteen tuntiin. Lisäksi, meidän tiedot osoittavat selvästi lisääntynyt pilkkominen tehokkuutta kasvava määrä dU, alkaen 40-60% (Viikunat. 3C ja S1).
sitten muutti opiskelemaan todellinen pilkkominen vaihe, poistaminen koskee sivuston jälkeen excision urasiili pohja., Seuraavat tiedossa strategioita kemiallisesti aiheuttama perustoimitukset sivuston pilkkominen solution20,30, jolloin AP-sivustot olivat sitten halkaistut joko emäksisissä olosuhteissa upottamalla taulukot 1:1 (v/v) liuosta etyleenidiamiini(EDA)/etanoli tai paneelit käsiteltiin happamissa olosuhteissa upottamalla osaksi 30% (v/v) liuos trikloorietikkahappoa vuonna dikloorimetaani, tai haihduttamalla pinnan array kuivumista. Kaikissa menetelmissä hoitoja tehtiin eri ajanjaksoina, 1-24 tuntia., Tämän jälkeen ryhmät olivat rehybridized, että Cy3-merkitty täydentäviä 25mer oligonukleotidi (QC25c) ja tuloksena fluoresenssi-intensiteettejä verrattiin jotka on saatu ennen UDG hoidon määrittämiseksi pilkkominen tehokkuutta. Tuloksena olevat pilkkoutumisnopeudet on ilmoitettu Kuvassa. 4.
Vähentää fluoresenssin intensiteetin jälkeen kemiallisesti aiheuttama perustoimitukset sivuston tissivakoani substraatit, joilla on vaihteleva määrä dU yhtiöittämisten ja ajan funktiona., Todellinen pilkkoutumistehokkuus korreloi DNA-substraatin pilkkoutumisesta johtuvan fluoresenssin voimakkuuden häviämisen kanssa. Fluoresenssivoimakkuuden väheneminen kirjattiin ja normalisoitiin kontrollilohkon (U0) tasolle. Mielivaltaisissa yksiköissä ilmoitetut normalisoidut intensiteetit piirrettiin kemiallisten käsittelyjen altistusajan kuluessa. DNA array oli käsitelty happamissa olosuhteissa (A), emäksisissä olosuhteissa (B) tai haihduttamalla pinnan kuivumista (C) ja eri valotuksilla (1, 2, 4, 8, 12 ja 20 tuntia)., Alustan osa sisälsi eri suhteissa dU nukleotidien merkitty eri väreillä: U0 (musta), U1 (punainen), U2 (vaalea vihreä), U3 (keltainen), U4 (sininen), U5 (vaaleanpunainen), U6 (turkoosi), U7 (harmaa), U8 (tumma punainen) ja U9 (tumma vihreä). Virhepalkit ovat SD.
emäksisissä olosuhteissa (Kuva. 4B) AP-alueiden pilkkoutuminen vaatii vähintään 2 tunnin itämisajan, jotta voidaan havaita merkittävä pilkkoutuminen (40-60%) substraateista. Kuitenkin käsitellään array hapolla tai kuivaus sen pinta (kuva., 4A,C, vastaavasti) tulokset selkeästi ja laaja pilkkominen jälkeen vain yksi tunnin (30 lähes 80% happamalla hoito), kun EDA-välitteisen perustoimitukset sivuston pilkkominen on minimaalinen tunnin kuluttua. On todennäköistä, että pilkkominen reaktio itse A-ja C-menetelmiä on edistettävä viimeisessä hybridisaatio vaiheessa, joko johtuvat lämpötilan tai läsnäolo amiini puskuriin., Kuitenkin, koska hybridisaatio on yhteinen kaikille kolme menetelmää, suuria eroja pilkkominen kinetiikan välillä perus-ja ei-perus hoitoja vihjaa mahdollisuuteen, että uusia AP-sivustot voi olla tuotettu läsnäolo happo, tai alipaineessa, jolloin saadaan lisää kantojen DNA-säikeet, jotka seuraavat pilkkominen reaktio voi tapahtua. Enää hoitoja, menetelmästä riippumatta, eivät merkittävästi muutu laajuus pilkkominen, yleensä lähestyy 40% – 80% riippuen määrä dU yhteisöiltä., Todellakin, me näemme, selkeä yleinen kasvu pilkkominen tehokkuutta kasvava määrä dU-yhteisöiltä, kaikissa testattu ehtoja.
lisäksi suorittaa kemiallisesti aiheuttama DNA-juosteen tissivakoani perustoimitukset-sivuston paikoissa, laatu microarray pinnalla tutkittiin. Tätä tarkoitusta varten, yhdenmukaisuus ominaisuudet array pinnat oli silmämääräisesti perustuu fluoresenssi-intensiteetit ja menetys fluoresenssi ei-cleavable ohjaus osa oli seurata., Huomasimme, että koskee sivuston pilkkominen emäksisissä olosuhteissa sallittu erityinen entsyymi-välitteisten pilkkominen dU sisältäviä sekvenssejä, mutta jätti ohjaussekvenssejä, lähes koskematon, kun taas happamissa olosuhteissa, DNA-juosteen pilkkominen havaittiin myös valvonnan osa puuttuu urasiili nukleotidit (Fig. S2). Pinnan kuivuminen johti myös Dt-vain ohjauslankojen hajoamiseen. Koska vain perustoimitukset sivuston pilkkominen emäksisissä olosuhteissa vältetään pinnan hajoaminen ja epäspesifinen menetys DNA, me suorittaa kaikki myöhemmät kokeilut näissä olosuhteissa., Näin varmistetaan, että ei-cleavable control-sekvenssit pysyvät vertailtavissa myös pitkän kemiallisen käsittelyn jälkeen.
Single – ja double-stranded UDG järjestyksessä riippuvuus
Koska meidän tulokset E. coli-UDG-välitteisen dU pilkkominen toimitetaan vain kohtalainen pilkkominen tehokkuutta DNA-säikeet, jotka sisältävät yhden dU yhteisöiltä (≈40%), kuulustelimme järjestyksessä spesifisyys UDG jotta voidaan mahdollisesti tunnistaa erittäin halkaistut dU-sisältää alustan. Tätä tarkoitusta varten suunnittelimme kaksijuovaisten ja yksijuovaisten DNA-sekvenssien kaksijuovaisten nukleiinihappojen kirjaston., Kirjasto koostuu 7mer permutable järjestyksessä yhden dU keskellä (kuva. 5). Permutation 3-nt flanking alueet, 5 ’- sekä 3 ’ dU tulokset 4096 ainutlaatuinen sekvenssejä. Double-stranded-muodossa, silmukka ja täydentäviä järjestyksessä 7mer lisättiin, mikä johtaa muodostumista hiusneula rakenne. Tiedostojen dG·dC emäsparin hiusneula varsi auttoi lisäämään sulamislämpötila hiusneula DNA-rakenne. Nämä emäsparin lisättiin single-stranded-substraattien pitääkseen ssDNA-ja dsDNA-malleja mahdollisimman samanlaisia., Lopulta jokaisen mallin 5’päähän lisättiin 25mer oligonukleotidi, jotta se toimisi hybridisaatiokohteena. Kuviossa on edustava kuva sekvenssimalleista. 5.
Kaaviokuva järjestyksessä design-tutkimuksessa E. coli-UDG järjestyksessä riippuvuuksia yksi- (A) ja double-stranded DNA substraatteja., (B) jotta voidaan tutkia UDG järjestyksessä riippuvuus, yhden dU on sisällytetty DNA strand ja suljettu 3 muunnosten emäkset kummallakin puolella. A design for the study of UDG järjestyksessä riippuvuus single-pulaan DNA substraatteja koostuu 15mer dT-ristisilloittaja polyakryyliamidigeelien valmisteluun, yhden dU suljettu 3 muunnosten emäkset kummallakin puolella, seurasi 5′ 25mer järjestyksessä (QC25) palvelee tavoite hybridisaatio sen 3′-Cy3-merkitty täydentäviä oligonukleotidi (QC25c). B UDG: n sekvenssiriippuvuuden tutkimiseen kaksijuosteisista DNA-substraateista sekvenssit oli suunniteltu muodostamaan hiusneulasilmukka., Tuloksena osa koostui 15mer dT-linkitys -, 11-nt varsi, joka vastaa single-stranded suunnittelu, joka sisältää muuttujan aluetta reunustaa dG·dC emäsparia, 4-nt loop seuraa toisiaan täydentäviä 11nt strand. 5 ’ lopussa syntetisoitiin hybridisoituva 25mer-kohdejakso (QC25).,
Vaikka terminaali merkintöjä DNA: fluoresoiva väriaine on kätevä tapa mitata suoraan fluoresenssin intensiteetti, se kuljettaa haitta on korkea fluoresenssi kohinaa, joka, erityisesti high-density-microarray, tekee tiedon louhinta ja tulkinta vaikeutuu. Siksi päätimme seurata pilkkoutumisreaktiota hybridisaation kautta liikkumattomiin sekvensseihin., Ennen hoidon UDG, single – ja double-stranded DNA: n substraatteja olivat hybridisoitiin, että merkittävä täydentävä 25mer oligonukleotidi ja skannattu saada alkuperäisen fluoresenssi-arvot. Sen jälkeen mikropiirit altistuivat UDG: lle eri ajanjaksoina. Kun seuraavan AP-sivuston pilkkominen emäksisissä olosuhteissa, paneelit olivat taas hybridisoitiin niiden Cy3-merkintä täydentää. Lasku fluoresenssi signaalin DNA-säikeet suhteessa pre-hoito fluoresenssi-arvot vastaa suoraan pilkkominen tehokkuutta., Suurin pilkkominen tehokkuutta noin 40% saatiin double-stranded-substraattien jälkeen UDG itämisaika on 2 minuuttia, ja hieman pienempi pilkkominen hinnat single-stranded-substraattien (Taulukko S1). Tämä alempi korko single-stranded on ristiriidassa aikaisempiin tutkimuksiin osoittaa, että ne ovat pilkottu nopeammin kuin niiden double-stranded equivalents13,47,48. Mielenkiintoista, hyvin lyhyt entsyymi inkubaatioiden (<1 min) edelleen johtaa merkittäviin pilkkominen tehokkuutta (30-35%)., Nämä lyhyessä ajassa pistettä ovat erityisen mielenkiintoisia, koska ne antavat selkeitä vihjeitä mahdollisista järjestyksessä mieltymykset. Jotta voidaan tunnistaa sekvenssin riippuvuutta UDG-DNA-välitteisen hajoamisen meidän joukko 4096 yksittäisiä säikeitä, keskityimme 1% (Kuva. 6)sekä 5% (Kuva. S3) sekvenssien kaikkein ja vähiten haljenneista osajoukoista. Edustava sekvenssi kuviot syntyy näistä sekvenssi osajoukot esitetään kuvassa. 6 ja lisätiedoissa.,
Edustaja järjestyksessä aiheita varten UDG-välitteisen urasiili pilkkominen on kaksinkertainen (A,B) ja single-stranded (C,D) DNA-säikeet. Substraatit olivat rauhoitettuna UDG eri ajanjaksot vaihtelevat 5 sekuntia-30 minuuttia (koska pilkkominen kuviot osoittivat juurikaan ole järjestyksessä riippuvuus, vain 5s, 30s, 60s ja 120s oli määritetty ssDNA)., Sekvenssi kuviot olivat poimittu 1% (41 4096 sekvenssit) useimmat halkaistut (A,C) ja vähiten halkaistut (B,D) sarjoissa kirjasto.
double-stranded DNA: ta (Kuva. 6A, B), tulokset osoittavat selkeän UDG-sekvenssisuosituksen G/C-rikkaille alueille, jotka tukevat uracilia. Toisaalta UDG vaikuttaa huonosti prosessoivan t·a-emäspareja sisältäviä kaksijuovaisia substraatteja. Aiheet on poimittu parempi ja huonompi UDG substraatteja ovat osittainen mukaisesti hyvin rajattu olemassa olevan kirjallisuuden data48,49,50. Seibert ym., arveltu, että tehokkuus E. coli-UDG liittyy energinen kustannukset DNA taivutus ja vääristymiä esiintyy parhaillaan erityisiä vaurioita tunnustamista. Molecular dynamics simulaatioita ja aika-ratkaistu fluoresenssi kokeiluja kaksi urasiili-sisältää kaksinkertaisen-pulaan DNA-sekvenssit, ne tunnistaa siitä, että tehokas taivutus voima ovat vakioita pienempi, jos dAs-tai dTs sijaitsevat vieressä urasiili nukleotidin, sen sijaan, dGs-ja dCs; ehdottaa, että dA/dT-rikkaat sekvenssit voisi olla enemmän helposti taivuttaa UDG ja siten paremmin processed49., Koska single-pulaan DNA on paljon joustavampi muoto DNA: ta, sen nopeampi käsittely raportoitu kirjallisuudessa saattaa johtua siitä, että pienempi energinen maksaa pilkkomaan substraatteja, jotka ovat luonnostaan joustavampi kuin dsDNA7,47,49,51. Taivutus voi kuitenkin olla ratkaiseva tekijä UDG pilkkominen spesifisyys ssDNA, jossa entsyymin tunnistaminen ja pilkkomaan kaikille alustoille yhtä hyvin, mikä ehkä selittää sen, ettei järjestyksessä konsensus dU-sisältää ssDNA., Se oli kuitenkin arveltu, että sekvenssi yhteydessä vaikutuksia edelleen laajentaa yksijuosteisen DNA: n, ja todellakin oli havaittu UDG herpes simplex-virus tyyppi 152, mutta on edelleen epäselvää, ihmisen tai E. coli-UDG. Slupphaug ym. mitattu järjestyksessä erityisyys Ihmisen UDG 34 dsDNA järjestyksessä yhteyksissä ja arveli, että dT 3′ dU aina tulokset hidas poisto samoin, hieman discordantly, korkea GC content50. Eftedal ym. arvioi sekä vasikan kateenkorvan että E. coli UDG: n pilkkoutumistehokkuuden 41 dsDNA-sekvenssistä ja löysi samanlaisen kuvion., Meidän huomattavasti suurempi joukko sekvenssejä, voimme samaa mieltä siitä, että dT 3′ dU aina tulokset hidas poisto, mutta meidän tiedot osoittavat selvästi, että dC, ja dG vähemmässä määrin, 3′ dU tuloksia nopea poisto. Emme pystyneet tunnistamaan merkittävää sekvenssiriippuvuutta dU excision ssDNA (Kuva. 6 C, D). On huomattava, että järjestys riippuvuus dsDNA-substraatteja, on selvää, lyhyen entsymaattinen hoitoja (5s, 30s, 60s, ja 120s), mutta hitaasti haalistuu pois pidempään UDG altistuminen (30min), mikä osoittaa, että kaikki materiaalit ovat lopulta hajonnut, kun se altistetaan entsyymi.,
katkaisukohdan optimointeja
Koska ei ole merkittäviä järjestyksessä riippuvuutta UDG-välitteisen urasiili leikkaaminen single-pulaan DNA syntyi meidän tutkimukset ja melko maltillinen pilkkominen tehokkuutta yhden dU yhteisöiltä saatiin, päätimme tutkia UDG-välitteisen dU leikkaaminen on enää yhden stranded-substraatteja, jotka sisältävät eri muotoja on useita, dU yhteisöiltä, joiden tavoitteena on tunnistaa erityisiä pilkkominen sivustoja, jotka ovat helposti entsymaattisesti saatavilla ja mahdollistaa nopea ja tehokas strand pilkkominen., Meidän logiikka on, että kasvava etäisyys anturin pinnasta tulisi antaa suurempi saavutettavuus pilkkominen, mutta tämä vaikutus voi kantaa yli pitkän välilevyt (>20-nt)53. Perustuu Fig: n tuloksiin. 3, odotamme myös, että suurempi määrä dU yhtiöittämisten johtaa suurempaan yleistä pilkkominen, mutta me ihmetellä, jos siellä on optimaalinen tiheys dU nukleotidien sisällä cleavable osa DNA-strand. Siksi olemme tutkineet, urasiili pilkkominen enää dU homopolymeerit (10, 15 ja 20mers) sekä oligomeerejä vaihtelevalla %dU koostumus., Prosenttiosuus dU sisällä oligomeerin oli laskettu suhteessa muiden neljän nukleotidin (dA, dC, dG ja dT) ja kokeellisesti saavutettu suorittamalla kytkentä reaktioita valmiiksi sekoitettu ratkaisuja dU/dA/dC/dG/dT phosphoramidites eri suhteissa (0:100, 12:88, 25:75, 50:50 tai 100:0, (v/v) dU:dA/dC/dG/dT). Sekvenssit, rakennettu poly-dT-liitintä eripituisia (dT1, dT5, dT10 ja dT15), ja dU sisältävä alue oli sitten lopetettiin a 25mer kohde sekvenssi hybridisaatio tarkoituksiin kuten on osoitettu Kuvassa. 7.,
pilkkominen tehokkuutta single-stranded-substraattien kanssa UDG tai KÄYTTÄJÄ entsyymejä. Kolme parametrit tutkitaan: linker pituus (sininen), dU-sisältää segmentin pituus (10 -, 15-tai 20-nt pitkä musta, harmaa ja vaalea harmaa, vastaavasti) ja dU sisältöä (0-100%, x-akselilla). Kaikki substraatit lopetetaan 5ʹ lopussa 25mer hybridisoituvalla sekvenssillä., Vastaava microarray hoidettiin joko UDG tai KÄYTTÄJÄ entsyymi (5 U, 1 h 37 °C) ja myöhemmin, jos UDG hoito, jossa on EDA – /EtOH 2 h. r.t. Pilkkominen tehokkuus vastaa menetys hybridisaatio fluoresenssi entsymaattisen käsittelyn jälkeen ja suhteessa 0%dU valvontaa.
Kun synteesi, 25mer oli hybridisoitiin sen täydentävän 5′-Cy3 merkitty oligonukleotidi ja microarray oli alttiina UDG 1 tunti., Sitten, pilkkominen perustoimitukset sivusto oli suoritetaan emäksisissä olosuhteissa, jonka jälkeen lopullinen rehybridization. Rinnakkain, me myös suorittaa pilkkominen määritys KÄYTTÄJÄN entsyymi, joka tässä tapauksessa poistaa tarpeen ylimääräisiä perustoimitukset sivuston pilkkominen menettely.
– entsyymin pitoisuus, jossa UDG seuraa perustoimitukset sivuston pilkkominen emäksisissä olosuhteissa (Kuva. 7, vas.), kirjasimme pilkkoutumistehokkuuden vaihtelevan 4%: sta 80%: iin ja selvät trendit kehittymässä., Esimerkiksi, pilkkominen tehokkuus kasvaa merkittävästi lisätä pituus dU sisältäviä alueella, jotta 10mer > 15mer > 20mer, maksimissaan ~50% pilkkominen saavutettavissa 10mer dU alueella, ja 80% maksimi 20mer dU alueella. Vastaavasti pidemmät linkkerit johtavat yleisesti korkeampaan pilkkoutumisnopeuteen. Nämä havainnot osoittavat, että pidemmät sekvenssit ovat paremmin tunnustettu ja vastaava urasiili emäkset paremmin leikattiin, jonka UDG, mikä puolestaan viittaa enemmän saavutettavuus enää substraattien entsyymin., Pilkkoutumistehokkuuteen vaikuttaa myös substraatin halkeamiskelpoisessa osassa olevien dU-nukleotidien määrä. Todellakin, urasiili homopolymeerit (100%dU) ovat lähes aina vähemmän halkaistut kuin niiden yhdisteiden välissä dU nukleotidit, ja tämä vaikutus on erityisen selvää, kun alustat ovat syntetisoitu yli lyhyt T1-linkkeri. Toisaalta, lisäämällä dU sisältöä 12 50% on tavannut yhä pilkkominen tehokkuutta, 50% dU näy olevan optimaalinen määrä., Näin, meidän koeolosuhteissa, UDG-välitteisen pilkkominen oli tehokkain pisin substraatteja, jossa puolet nukleotidien cleavable osa on dU (80% pilkkominen tehokkuus). Tämä suuntaus, sekä tiedot esitetään kuvassa. 3, ehdottaa, että UDG voi tunnistaa ja Sitoutua useisiin du incorporations, kunhan dUs erotetaan kanoninen DNA nukleotidit.
Kun taas lyhyen homopolymeerit ovat yleisesti tunnettu on huono UDG-substraatteja, meillä on myös odotettavissa tarkkailla alhainen pilkkominen hinnat 20mer cleavable alueilla, koska tällaisia alustoja ovat todennäköisesti löytyy DNA: ta., In vivo -, urasiili emäkset tapahtuu pääasiassa DNA-säikeet, koska misincorporation aikana lisääntymään tai koska deamination8,9 ja molemmat prosessit ovat epätodennäköisiä niin korkea taajuus muodostaa homopolymeerit. Kuitenkin, kohtalainen tai suuri pilkkominen hyötysuhde on noin 60% pitkän 20mer dU homopolymeerit on saatu, mutta onko ne homopolymeerit käsitellään hitaammin kuin substraatit, joilla on pienempi %dU sisältö on vielä tutkittava.
samankaltaisen DNA-ryhmäkirjaston hoitaminen käyttäjän entsyymijärjestelmällä (Kuva., 7, oikealla) johtaa tyydyttävä lohkaisu single-stranded-substraattien, joiden pilkkominen trendejä hieman verrattavissa UDG tapauksessa, mutta muutamia poikkeuksia lukuun ottamatta. Ensimmäinen, korkein pilkkominen hyötysuhde on pienempi kuin UDG/EDA-järjestelmä (55% vs. 80%, vastaavasti), joka voi johtua hitaampi käsittely koskee sivustoja Endonuclease VIII verrattuna yhteinen perus-hoidon EDA., Toiseksi, siellä näyttää olevan heikompi ilman syrjintää cleavable alueella verrattuna UDG/EDA, vain 20-25% ero korkeintaan välillä on lyhyt (10-nt) ja pitkä (20-nt) dU sisältäviä alueita, kun UDG yksin-hoito johti suuria eroja pilkkominen tehokkuutta sama 10 ja 20mers (jopa 50% ero). Jälleen, tämä vaikutus voi johtua eroista käsittelyaste AP sivustoja. Lopuksi näyttää siltä, että du-homopolymeerit hajoavat samassa määrin riippumatta linkkerin tai Alustan pituudesta., Tämä puute syrjinnän KÄYTTÄJÄ entsyymi tapauksessa ja verrattuna UDG-välitteisen pilkkominen tiedot viittaavat siihen, että on olemassa useita, peräkkäisiä AP sivustoja on rajoittava tekijä entsymaattinen poisto AP sivustoja.
yhteenvetona, meidän käsissä, me todettiin, että paras pilkkominen tehokkuusetuja voidaan saavuttaa UDG-välitteisen pilkkominen seuraa EDA hoitoa pidempään, ei-homopolymeric urasiili-sisältää substraatteja. Tällöin 50% dU: ta sisältävät yksijuosteiset sekvenssit voidaan tehokkaasti halkaista, joskin kahdessa vaiheessa., Lyhyt, yhden askeleen hoito, jossa KÄYTTÄJÄ entsyymi cocktail voi myös kätevästi cleave jopa 50% dU-sisältää yhden osa tunnissa, kuitenkin ilmeisesti pienempi erotteleva voima tämä erityisesti entsymaattinen käsittely voi olla vähemmän hyödyllistä, kun etuuskohteluun pilkkominen tarvitaan.