Valutazione polmonare. I test di funzionalità polmonare (PFT) sono stati fatti con uno spirometro di Brentwood nel nostro ufficio. Alcuni pazienti erano stati sottoposti a test altrove.
Test immunitari. I test sono stati eseguiti presso i Laboratori di Immunoscienze sotto la direzione di A. Wojdani, Ph. D.. In considerazione dell’importanza di questi test nel contesto di questa valutazione, la metodologia è descritta in dettaglio.,
Preparazione di coniugati formaldeide-albumina sierica umana (F-HSA) e formaldeide-albumina sierica bovina (F-BSA):
È stato eseguito un confronto elettroforetico e immunoelettroforetico di HSA, BSA Con F-HSA e F-BSA per determinare l’occorrenza della coniugazione. La coniugazione è stata evidenziata dalla mobilità alterata di F-HSA, F-BSA quando è stata confrontata rispettivamente con HSA o BSA. Inoltre, il numero di gruppi amminici liberi presenti in F-HSA o F-BSA è stato determinato dal metodo di Snyder e Sobocinski (1975) ed è stato utilizzato per valutare la quantità di sostituzione., Il numero di gruppi amminici legati alla formaldeide era 26 per HSA e 31 per BSA. In questo calcolo, è stata considerata la formazione di cross-linking intermolecolare.
Preparazione di toluene diisocianato-albumina sierica umana (TDI-HSA) e albumina sierica bovina (TDI-BSA) coniugati:
Questa preparazione era simile ai metodi di Dewar e Baur (1982). Secondo questo metodo, 1g HSA o 1g BSA è stato sciolto in 100 ml di una soluzione tampone contenente cloruro di potassio (0,05 mol / l), borato di sodio (0,05 mol/l), PH 9,4 e raffreddato a 4 C. Diossano (10 ml) contenente 0.,15 ml di diisocianato di toluene sono stati quindi aggiunti a gocce mescolando per un periodo di 3 ore, seguita dall’aggiunta di 2 ml di etanolamina, centrifugazione, filtrazione per dialisi e liofilizzazione. Simile a F-HSA e F-BSA, la coniugazione è stata confermata mediante elettroforesi e determinazione di gruppi amminici liberi presenti nel coniugato. Il numero di gruppi amminici legati alla TDI è stato 37 per HSA e 43 per BSA. Inoltre, l’analisi spettrografica del coniugato è stata intrapresa secondo Zeiss et. al. (1980)., C’è stato un marcato aumento dell’assorbimento da 230 a 260 nm che ha indicato che la TDI era diventata legata covalentemente al vettore proteico. Questo aumento dell’assorbimento è stato d’accordo con la determinazione del gruppo NH2 solo 76% per HSA e 81% per BSA
Preparazione di anidride trimellitica-albumina sierica umana (TMA-HSA) e anidride trimellitica albumina sierica bovina (TMA-BSA):
Per preparare questi coniugati 25 mg. di TMA è stato sciolto in 0,5 ml di diossano e aggiunto goccia a goccia a 25 mg di HSA o BSA disciolto in 5 ml di freddo 7% NaHCO3 in acqua., Dopo agitazione per 60 minuti a 4 C i coniugati sono stati dializzati contro quattro cambiamenti di 0,1 M NaHCO3 e un cambiamento di tampone. Infine i coniugati sono stati filtrati e mantenuti a -20 C fino all’uso. Sono state effettuate analisi OD di TMA-HSA e TMA-BSA per determinare il numero di residui di TMA legati alla proteina portante corrispondente. La concentrazione della proteina portante è stata convertita in concentrazione molare con il peso molecolare di HSA e BSA. Dal rapporto tra la concentrazione molare del ligando TMA e il vettore proteico, è stato calcolato il rapporto tra residui di TMA per molecole di vettore., Si stima che TMA-HSA contenga 5 residui di TMA per molecole di HSA e per TMA-BSA sette residui per molecola di albumina (Pien et al., 1988).
Preparazione dell’anidride ftalica-albumina di siero umano (PA-HSA) e anidride Ftalica albumina di siero bovino (PA-BSA) coniugati:
Questi aptene-coniugati sono stati preparati aggiungendo 75 mg di PA per un raffreddato soluzione di 300 mg di HSA o BSA in 100 ml di H2O. La miscela di reazione è stata agitata notte, dialyzed contro 0,1 M PBS utilizzo di tubi con un taglio di 8000 dalton. Utilizzando il metodo di Zeiss et. al. (1977) sono stati calcolati i rapporti molari., I rapporti molari sono stati trovati per essere 22/28 per PA / HSA e 25/30 per PA/BSA.
Preparazione di coniugati dell’anello benzenico HSA (B-HSA) e dell’anello benzenico BSA (B-BSA):
Per questi preparati, 40 mg. di acido P-aminobenzoico è stato sciolto in 2 ml di 1 N HCL e raffreddato per immersione in un bagno di ghiaccio. Una soluzione fredda di 14 mg/ml è stata aggiunta a goccia. Dopo ogni aggiunta, la miscela è stata agitata per 30 secondi. In parallelo, un grammo di HSA o BSA è stato sciolto in acido borico 0,16 M cloruro di sodio (0-15 M) tampone PH 9,0 (PH è stato aumentato con NaOH)., I bicchieri contenenti le soluzioni di albumine erano circondati da un bagno di ghiaccio su agitatore magnetico. La soluzione di sale di diazonio è stata aggiunta a gocce, con rapida agitazione alla soluzione proteica fredda. Dopo l’aggiunta di ogni goccia il pH viene riadattato a 9,0 a 9,5 con un NaOH normale. Quando tutta la soluzione era stata aggiunta, la reazione è stata lasciata continuare con agitazione lenta per almeno un’ora con ulteriori aggiunte di soluzione di NaOH e mantenendo il pH nell’intervallo da 9,0 a 9,5., Piccole molecole non reagite sono state rimosse mediante dialisi estesa o tramite passaggio attraverso una colonna di sephadex G-25 nella stanza fredda, con una soluzione salina isotonica come tampone eluente. Sono state effettuate analisi OD dello sviluppo del colore arancione di B-HSA e B-BSA per determinare il numero di residui B legati alla corrispondente proteina portante. La quantità di sostituzione B per HSA era approssimativamente 41 e per BSA 53 (Migrdichian, 1957).
Determinazione dell’anticorpo:
Anticorpi specifici contro F-HSA, TDI-HSA, TMA-HSA, PA-HSA e B-HSA sono stati analizzati mediante un test ELISA non competitivo., I pozzetti di piastre microtitolari (Dynatech, Alexandria, VA) sono stati rivestiti con 100 1 di soluzioni antigeniche (100 g/ml) in 0,1 M PBS PH 7,2 durante la notte a 4 C. Le piastre sono state lavate 4 volte con 0,1 M PBS contenenti 0,05% di interpolazione 20 tra ogni passaggio. I siti di assorbimento libero sono stati bloccati con albumina sierica bovina libera da proteasi al 2% a temperatura ambiente per 4 ore e conservati a -20 C fino all’impiego.,
Procedura Analitica:
La procedura sono le seguenti: (1) il lavaggio quattro volte, (2) oltre 100 1 di siero diluito (1:2 per le IgE e 1:100 per le IgM e IgG) in PBS tween-20 con 1% BSA (3) incubazione per 4 ore a 20 ° C, seguita da un lavaggio 4 volte, (4) oltre 100 1 ottimale per la diluizione di fosfatasi alcalina purificato per affinità di capra anti-umano IgE ( ) (1:200), IgM (1:500) e anti-IgG (1:1000), acquistato da KPI (Maryland) (5) incubazione per 120 minuti a 20 ° c. (6) lavaggio 6 volte, (7), oltre 100 1 P-nitrofenil fosfato (Sigma Chemical Co.,) (8) incubazione per 60 minuti a 20 C (9) aggiunta di 50 1 di 3 N soluzione di idrossido di sodio e (10) lettura duplicata. I risultati sono stati calcolati sulla base di assorbenze di campioni duplicati di 405 nm utilizzando microtiter reader. Tutti i campioni sono stati letti contro un antigene HSA come controllo del legame non specifico per F-HSA, TDI-HSA, TMA-HSA, PA-HSA e B-HSA. I risultati sono stati espressi come titolo. Il titolo è l’ultima diluizione del siero che conferisce assorbanza due volte rispetto al controllo HSA.,
Specificità e studi di inibizione incrociata:
Per la determinazione della specificità anticorpale è stato intrapreso uno studio di inibizione incrociata. Sieri positivi per ciascun coniugato aptene-proteina sono stati eseguiti dopo un’adeguata incubazione e precipitazione con incrementi decuplicati di HSA o BSA legati all’aptene come inibitori per coprire la gamma di anticorpi contro l’eccesso di antigene. Questo intervallo era compreso tra 50 g e 1000 g per apten-BSA e 80 g e 1000 g per apten-RSA., Dopo l’incubazione a 37 C e la rimozione del precipitato mediante centrifugazione, i campioni dello studio di inibizione incrociata prima e dopo sono stati quindi collocati su piastre con pozzetti rivestiti con il coniugato specifico. Le fasi successive sono state seguite come descritto sopra per lo studio ELISA.
Il legame anticorpale IgG e IgM a diversi coniugati è stato inibito da hapten-HSA o hapten-BSA dal 36-85%. Ad una data concentrazione, sia hapten-HSA che hapten-BSA hanno inibito il livello di anticorpi in modi simili.,
È stata osservata una parziale inibizione del legame degli anticorpi IgE con diversi coniugati apteni quando il siero è stato pre-incubato con apten-HSA o apten-BSA. Questa osservazione incompleta dell’inibizione dell’anticorpo IgE era principalmente correlata alla non disponibilità di siero con alti titoli IgE contro diverse sostanze chimiche nel nostro laboratorio.,
Determinazione dei livelli normali di anticorpi (controlli):
Sulla base delle procedure di cui sopra, sono stati esaminati 160 campioni di donatori di sangue di individui sani, di entrambi i sessi, di età compresa tra 22 e 55 anni, per i livelli di anticorpi contro F-HSA, TD-HSA, TMA-HSA, PA-HSA e B-HSA. Il titolo medio era 1: 800 400 per IgG, 1:3200 1600 per IgM e 1: 8 4 per IgE. Pertanto, nel nostro laboratorio i titoli superiori a 1: 1600 per IgG, 1:6400 per IgM e 1: 16 per IgE sono considerati positivi.,
In un dato paziente, l’aumento o la diminuzione dei titoli anticorpali in più di una diluizione sono stati considerati significativi (vedere Tabelle).
Enumerazione dei sottoinsiemi linfocitari:
Un citometro a flusso laser singolo (Profilo Epics: Coulter Epics, Inc., Hialeah, FL) che discrimina in avanti e ad angolo retto dispersione della luce, così come due colori, è stato utilizzato con un pacchetto software (Quad Stat: Coulter). Le popolazioni di cellule mononucleate sono state determinate mediante immunofluorescenza diretta bicolore utilizzando una tecnica di colorazione del sangue intero con l’anticorpo monoclonale appropriato e la citometria a flusso (Fletcher et al.,, 1989) Le seguenti coppie di isotiocianato di fluoresceina (FITC), o ficoeritrina (PE)-anticorpi monoclonali coniugati (Coulter immunologia) sono stati selezionati: T11-RDI/B4-FITC, T4-RDI/T8-FITC, T3-FITC/NKH-1-RDI e T11-FITC/Tal-PE per la determinazione di T-cellula/cellula B, T-helper/T-suppressor, NKHT3+ /NKHY3 e per il percorso alternativo di attivazione dei linfociti, rispettivamente.
Per monitorare i marcatori linfocitari, sono state impostate mappe bat sulla popolazione linfocitaria della dispersione della luce ad angolo in avanti rispetto a un istogramma di dispersione della luce di 90., È stata determinata la percentuale di cellule macchiate positivamente per ciascuna coppia di marcatori, nonché la percentuale di cellule doppiamente macchiate. Le stime del numero assoluto di linfociti positivi per i rispettivi marcatori di superficie sono state determinate moltiplicando il numero di cellule linfocitarie periferiche per la percentuale di cellule colorate positivamente per ciascuna coppia di marcatori. Inoltre, è stata determinata la percentuale di cellule doppiamente macchiate., Le stime del numero assoluto di linfociti positivi per i rispettivi marcatori di superficie sono state determinate moltiplicando il numero di cellule linfocitarie periferiche per la percentuale di cellule positive per ciascun marcatore di superficie.
Misurazione degli anticorpi della proteina di base anti-mielina:
La proteina di base della mielina umana (HMBP) è stata preparata con il metodo di Diebler et al. (1972) e controllato per la purezza mediante elettroforesi su gel di poliacrilammina. L’antisiero a HMBP è stato indotto nei conigli mediante iniezione ripetuta di HMBP nell’adiuvante completo di Freund., L’attività anticorpale nei sieri di coniglio e nei campioni del paziente è stata rilevata aggiungendo diverse diluizioni (da 1:100 a 1:10.000) di sieri ai pozzetti di una piastra di microtitolazione precedentemente rivestita con HMBP come segue: HMBP 250 g/ml è stato sciolto in tampone carbonato, PH 9,6 e 200 l di questa soluzione sono stati aggiunti a ciascun pozzetto. Dopo incubazione, lavaggio e blocco come sopra, 200 1 di coniglio diluito o siero umano sono stati aggiunti ai pozzetti. Dopo l’incubazione per I ora a 37 C i sieri sono stati scossi dai pozzetti e poi sono stati lavati 5 volte con la soluzione di lavaggio., 200 1 di capra anti-coniglio coniugato con perossidasi o capra anti IgG umana, IgM o IgA (diluizione ottimale) sono stati aggiunti al pozzetto appropriato. Dopo incubazione e lavaggio ripetuto 200 1 di substrato ABTS sono stati aggiunti a ciascun pozzetto. Le piastre sono state incubate per un’ora a temperatura ambiente e lette in un lettore di microtiteri a 405 tun di lunghezza d’onda. Utilizzando antisieri di coniglio; è stata tracciata una curva di titolazione e i sieri del paziente sono stati confrontati con questa curva standard., Sulla base di più di 200 controlli e determinazioni del campione dei pazienti, sono stati considerati positivi litri superiori a 1:2000 per IgA, 1:5000 per IgM e 1:8000 per IgG.