SDS-PAGE (sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis) è comunemente usato in laboratorio per la separazione delle proteine in base al loro peso molecolare. È una di quelle tecniche che viene comunemente utilizzata ma non spesso completamente compresa. Quindi proviamo a sistemare le cose.
SDS-PAGE separa le proteine in base al loro peso molecolare, in base ai loro tassi differenziali di migrazione attraverso una matrice di setacciatura (un gel) sotto l’influenza di un campo elettrico applicato.,
Rendendo la velocità di migrazione delle proteine proporzionale al peso molecolare
Il movimento di qualsiasi specie carica attraverso un campo elettrico è determinato dalla sua carica netta, dal suo raggio molecolare e dalla grandezza del campo applicato. Ma il problema con le proteine nativamente piegate è che né la loro carica netta né il loro raggio molecolare dipendono dal peso molecolare. Invece, la loro carica netta è determinata dalla composizione aminoacidica cioè la somma degli amminoacidi positivi e negativi nella proteina e nel raggio molecolare dalla struttura terziaria della proteina.,
Quindi, nel loro stato nativo, diverse proteine con lo stesso peso molecolare migrerebbero a velocità diverse in un campo elettrico a seconda della loro carica e della loro forma 3D.
Per separare le proteine in un campo elettrico basato solo sul loro peso molecolare, dobbiamo distruggere la struttura terziaria riducendo la proteina a una molecola lineare e in qualche modo mascherare la carica netta intrinseca della proteina. Ecco dove SDS entra in gioco.,
Il ruolo di SDS (et al)
SDS è un detergente presente nel buffer del campione SDS-PAGE dove, insieme a un po ‘ di ebollizione e un agente riducente (normalmente DTT o B-ME per abbattere i legami proteina-proteina disolfuro), interrompe la struttura terziaria delle proteine. Questo porta le proteine piegate verso il basso per molecole lineari.
SDS ricopre anche la proteina con una carica negativa uniforme,che maschera le cariche intrinseche sui gruppi R. SDS lega abbastanza uniformemente alle proteine lineari (intorno a 1.,4g SDS/ 1g protein), il che significa che la carica della proteina è ora approssimativamente proporzionale al suo peso molecolare.
SDS è anche presente nel gel per assicurarsi che una volta che le proteine sono linearizzate e le loro cariche mascherate, rimangono così per tutta la corsa.
Il fattore dominante nel determinare una proteina rivestita con SDS è il suo raggio molecolare., Le proteine rivestite con SDS hanno dimostrato di essere molecole lineari, larghe 18 Angstrom e con lunghezza proporzionale al loro peso molecolare, quindi il raggio molecolare (e quindi la loro mobilità nel gel) è determinato dal peso molecolare della proteina. Poiché le proteine rivestite con SDS hanno lo stesso rapporto tra carica e massa, non ci sarà migrazione differenziale basata sulla carica.
La matrice Gel
In un campo elettrico applicato, le proteine trattate con SDS ora si sposteranno verso l’anodo positivo a velocità diverse a seconda del loro peso molecolare., Queste diverse mobilità saranno esagerate a causa dell’ambiente ad alto attrito di una matrice di gel.
Come suggerisce il nome, la matrice di gel utilizzata per SDS-PAGE è la poliacrilammide, che è una buona scelta perché è chimicamente inerte e, in modo cruciale, può essere facilmente composta a varie concentrazioni per produrre diverse dimensioni dei pori dando una varietà di condizioni di separazione che possono essere modificate a seconda delle esigenze. Potresti ricordare che in precedenza ho scritto un articolo sul meccanismo della polimerizzazione dell’acrilammide.,
Il sistema tampone discontinuo e il gel impilabile – allineandoli sulla linea di partenza
Per condurre la corrente dal catodo (negativo) all’anodo (positivo) attraverso il gel, è ovviamente necessario un buffer. Per lo più usiamo il sistema di buffer discontinuo Laemmli. “Discontinuo” significa semplicemente che il buffer nel gel e il serbatoio sono diversi.
In genere, il sistema è impostato con un gel impilabile a pH 6.8, tamponato da Tris-HCl, un gel funzionante tamponato a pH 8.8 da Tris-HCl e un tampone elettrodo a pH 8.3., Il gel stacking ha una bassa concentrazione di acrilammide e il gel running una maggiore concentrazione in grado di ritardare il movimento delle proteine.
Quindi cosa c’è con tutti quei diversi pH?
Bene, la glicina può esistere in tre diversi stati di carica, positivi, neutri o negativi, a seconda del pH. Questo è mostrato nello schema seguente. Il controllo dello stato di carica della glicina da parte dei diversi buffer è la chiave per l’intera cosa del gel impilabile.,
Quindi ecco come funziona il gel di impilamento. Quando l’alimentazione è accesa, gli ioni glicina caricati negativamente nel buffer dell’elettrodo pH 8.3 sono costretti ad entrare nel gel di impilamento, dove il pH è 6.8. In questo ambiente, la glicina passa prevalentemente allo stato zwitterionico (caricato in modo neutro). Questa perdita di carica li fa muovere molto lentamente nel campo elettrico.
Gli ioni Cl (da Tris – HCl) d’altra parte, si muovono molto più rapidamente nel campo elettrico e formano un fronte ionico che migra davanti alla glicina., La separazione di Cl – dal contatore-ion Tris (che ora si sta muovendo verso l’anodo) crea una zona stretta con un gradiente di tensione ripido che tira la glicina lungo dietro di esso, con conseguente due fronti strettamente separati di ioni migratori; il Cl – front altamente mobile, seguito dal più lento, per lo più neutro fronte glicina.,
Tutte le proteine nel campione di gel hanno una mobilità elettroforetica che è intermedia tra l’estremo della mobilità della glicina e del Cl-, quindi quando i due fronti attraversano bene il campione, le proteine sono concentrate nella zona stretta tra i fronti Cl – e glicina.
E sono fuori!
Questa processione continua fino a quando non colpisce il gel in esecuzione, dove il pH passa a 8.8. A questo pH le molecole di glicina sono per lo più caricate negativamente e possono migrare molto più velocemente delle proteine., Quindi il fronte della glicina accelera oltre le proteine, lasciandole nella polvere.
Il risultato è che le proteine vengono scaricate in una banda molto stretta all’interfaccia dei gel di impilamento e corsa e poiché il gel di corsa ha una maggiore concentrazione di acrilammide, che rallenta il movimento delle proteine in base alla loro dimensione, inizia la separazione.
Di cosa si trattava?
Se ti stai ancora chiedendo perché è necessario il gel impilabile, pensa a cosa succederebbe se non ne avessi usato uno.,
I pozzi di gel sono profondi circa 1 cm e in genere è necessario riempirli sostanzialmente per ottenere abbastanza proteine sul gel. Quindi, in assenza di un gel impilabile, il campione si siederebbe sopra il gel in esecuzione, come una banda fino a 1 cm di profondità.
Piuttosto che essere allineati insieme e colpire il gel in esecuzione insieme, ciò significherebbe che le proteine nel campione entrerebbero tutte nel gel in esecuzione in momenti diversi, con conseguente bande molto macchiate.,
Quindi il gel impilabile assicura che tutte le proteine arrivino al gel in esecuzione allo stesso tempo, quindi le proteine dello stesso peso molecolare migreranno come bande strette.
Separazione
Una volta che le proteine sono nel gel in esecuzione, vengono separate perché le proteine di peso molecolare superiore si muovono più lentamente attraverso il gel di acrilammide poroso rispetto alle proteine di peso molecolare inferiore. La dimensione dei pori nel gel può essere modificata a seconda della dimensione delle proteine che si desidera separare modificando la concentrazione di acrilammide. I valori tipici sono mostrati di seguito.,
Per un intervallo di separazione più ampio, o per proteine difficili da separare, è possibile utilizzare un gel sfumato con strati di concentrazione crescente di acrilammide.