UDG-mediata uracile e l’asportazione chimica AP sito di clivaggio su microarray
il filamento di DNA di scissione mediata da UDG si compone di due fasi distinte: l’escissione di base uracile seguita dalla scissione del conseguente abasic sito. I due passaggi possono essere monitorati separatamente su microarray di DNA., In primo luogo, i siti abasici sono generati trattando la matrice con UDG e in una seconda fase, la scissione del filo viene indotta esponendo gli oligonucleotidi del DNA legati alla superficie contenenti siti abasici a condizioni acide o basiche o evaporando la superficie a secchezza. Tali strategie chimiche per fendere i siti abasici sui filamenti di DNA eliminano la necessità di ulteriore scissione enzimatica e consentono di studiare la cinetica UDG in modo indipendente., A tale scopo, matrici di sequenze di DNA 30mer con un numero crescente di DU-incorporazioni non consecutive (dU1-dU9) sono state progettate e sintetizzate mediante fotolitografia dell’acido nucleico senza maschera, utilizzando la corrispondente fosforammidite DU fotosensibile (Fig. 2). Ogni filamento di DNA è stato sintetizzato con un DT15-linker alla superficie di vetro e terminato al 5 ‘ – fine con una sequenza bersaglio 25mer per l’ibridazione (QC25), come indicato in Fig. 3.,
Molecular structure of the 5′-NPPOC deoxyuridine 3′-phosphoramidite (in the text referred to as dU or uracil nucleotide.
(A) Sequence design for the investigation of uracil and abasic site cleavage on microarrays., Ogni sequenza è costituita da un DT15-linker, quindi un 30mer senza dUs (controllo) o un numero crescente di DU-incorporazioni (da 1 a 9) sostituendo dTs nella seguente sequenza: 5′-TTA CCA TAG AAT CAT GTG CCA TAC ATC ATC-3′. All’estremità 5′, un controllo 25mer è sintetizzato (QC25), servente come obiettivo per l’ibridazione al suo oligonucleotide complementare 3′-Cy3-marcato (QC25c). Il processo di scissione è stato monitorato registrando l’intensità di fluorescenza basata sull’ibridazione prima e dopo la scissione mediata da UDG dei nucleotidi di uracile. B) Piccolo estratto (ca., 7% dell’area di sintesi totale) delle scansioni di fluorescenza prima e dopo l’esposizione enzimatica. Le scansioni mostrano l’intensità della fluorescenza, risultante dall’ibridazione ad un oligonucleotide complementare etichettato. I microarray sono stati scansionati con una risoluzione di 5 µm. (C) Diminuzione dell’intensità della fluorescenza per l’escissione di uracile mediata da UDG (generando così siti abasici) in funzione del numero di incorporazioni di nucleotidi dU per substrato di DNA. Le effettive efficienze di scissione sono correlate con la perdita di intensità di fluorescenza derivante dalla scissione del substrato del DNA., L’array è stato incubato per un’ora con UDG e i siti abasici generati sono stati successivamente scissi in condizioni alcaline. La diminuzione dell’intensità della fluorescenza è stata registrata e normalizzata al filo di controllo (U0). Le intensità normalizzate, indicate in unità arbitrarie, sono state tracciate sul numero di DUS per substrato di DNA. Le barre di errore sono SD.
La posizione di tutte le sequenze di sonda insieme ai corrispondenti replicati e fili di controllo che trasportano DT invece dei nucleotidi dU è stata randomizzata sulla superficie del microarray., Prima dell’elaborazione enzimatica, le sequenze della sonda del DNA sono state ibridate all’oligonucleotide complementare 25mer marcato Cy3 (QC25c) per determinare i valori iniziali di intensità di fluorescenza. L’etichettatura 3 ‘ – Cy3 è stata utilizzata per prevenire possibili artefatti di fluorescenza dovuti alle interazioni del colorante con il numero variabile di dUs46. I microarray sono stati quindi esposti a UDG di origine commerciale da E. coli e la scissione del sito abasico è stata successivamente effettuata in varie condizioni. Il tempo di esposizione ottimale degli enzimi è stato determinato negli esperimenti iniziali. I nostri risultati (Fig., S1) mostrano che dopo l’aggiunta dell’enzima, l’efficienza di scissione aumenta significativamente con il tempo, fino a un’ora, raggiungendo un’efficienza di circa il 50-60%, con solo lievi cambiamenti dopo un’ulteriore esposizione a UDG. Impostiamo così il tempo di esposizione ottimale a un’ora. Inoltre, i nostri dati mostrano chiaramente una maggiore efficienza di scissione con un numero crescente di dU, da 40 a 60% (Fig. 3C e S1).
Si è poi passati a studiare l’effettiva fase di scissione, la rimozione del sito abasico dopo l’asportazione della base di uracile., Noti seguenti strategie per indotta chimicamente abasic sito di clivaggio in solution20,30, risultante AP-siti sono state poi trattate sia in condizioni alcaline, immergendo le matrici in un 1:1 (v/v) soluzione di etilendiammina(EDA)/etanolo, o le matrici sono stati trattati in condizioni acide, immergendo in un 30% (v/v) soluzione di acido tricloroacetico in diclorometano, o dall’evaporazione della superficie della matrice a secchezza. In tutti i metodi, i trattamenti sono stati eseguiti per diversi periodi di tempo, che vanno da 1 a 24 ore., Successivamente, gli array sono stati riibridizzati nell’oligonucleotide complementare 25mer marcato Cy3 (QC25c) e le intensità di fluorescenza risultanti sono state confrontate con quelle ottenute prima del trattamento UDG per determinare l’efficienza di scissione. I tassi di scissione risultanti sono indicati in Fig. 4.
Diminuzione dell’intensità della fluorescenza dopo scissione del sito abasico indotta chimicamente su substrati con numero variabile di incorporazioni dU e in funzione del tempo., Le effettive efficienze di scissione sono correlate con la perdita di intensità di fluorescenza, risultante dalla scissione del substrato del DNA. La diminuzione dell’intensità della fluorescenza è stata registrata e normalizzata a quella del filo di controllo (U0). Le intensità normalizzate, indicate in unità arbitrarie, sono state tracciate sul tempo di esposizione per i trattamenti chimici. L’array di DNA è stato trattato in condizioni acide (A), alcaline (B) o evaporando la superficie a secchezza (C) e per vari tempi di esposizione(1, 2, 4, 8, 12 e 20 ore)., I fili del substrato contenevano diversi rapporti di nucleotidi dU indicati con diversi colori: U0 (nero), U1 (rosso), U2 (verde chiaro), U3 (giallo), U4 (blu), U5 (rosa), U6 (turchese), U7 (grigio), U8 (rosso scuro) e U9 (verde scuro). Le barre di errore sono SD.
In condizioni di base (Fig. 4B), la scissione dei siti AP richiede un periodo minimo di incubazione di 2 ore al fine di osservare una scissione significativa (40-60%) dei substrati. Tuttavia, trattando l’array con un acido o asciugandone la superficie (Fig., 4A, C, rispettivamente) si traduce in una scissione chiara ed estesa dopo solo un’ora (da 30 a quasi 80% con un trattamento acido), quando la scissione del sito abasico mediata da EDA è minima dopo un’ora. È probabile che la reazione di scissione stessa nei metodi A e C sia promossa nella fase finale di ibridazione, a causa della temperatura o della presenza di un’ammina nel tampone., Tuttavia, poiché l’ibridazione è comune a tutti e tre i metodi, le grandi differenze nella cinetica di scissione tra trattamenti di base e non di base suggeriscono la possibilità che ulteriori siti AP possano essere prodotti in presenza di un acido, o sotto pressione ridotta, producendo posizioni aggiuntive sui filamenti di DNA in cui può verificarsi una successiva reazione di scissione. I trattamenti più lunghi, indipendentemente dal metodo, non modificano significativamente l’entità della scissione, di solito si avvicina al 40% all ‘ 80% a seconda del numero di incorporazioni dU., In effetti, vediamo un chiaro aumento generale dell’efficienza di scissione con un numero crescente di DU-incorporazioni, in tutte le condizioni testate.
Oltre a eseguire la scissione del filamento di DNA indotta chimicamente su posizioni del sito abasico, è stata esaminata la qualità della superficie del microarray. A tale scopo, è stata ispezionata visivamente l’uniformità delle caratteristiche sulle superfici dell’array in base alle intensità di fluorescenza ed è stata monitorata la perdita di fluorescenza per i fili di controllo non scindibili., Abbiamo scoperto che la scissione del sito abasico in condizioni alcaline consentiva una scissione specifica mediata da enzimi di sequenze contenenti dU, ma lasciava le sequenze di controllo praticamente intatte, mentre in condizioni acide, la scissione del filamento di DNA è stata osservata anche per i fili di controllo privi di nucleotidi di uracile (Fig. S2). L’essiccazione della superficie ha anche portato alla degradazione dei fili di controllo solo dT. Poiché solo la scissione del sito abasico in condizioni alcaline evita la degradazione superficiale e la perdita non specifica di DNA, abbiamo eseguito tutti gli esperimenti successivi in queste condizioni., Ciò assicura che le sequenze di controllo non scindibili rimangano disponibili per il confronto anche dopo un lungo trattamento chimico.
Dipendenza dalla sequenza UDG a singolo e doppio filamento
Poiché i nostri risultati sulla scissione DU mediata da E. coli UDG hanno fornito solo efficienze di scissione moderate per i filamenti di DNA contenenti incorporazioni DU singole (≈40%), abbiamo interrogato la specificità della sequenza di UDG al fine di identificare potenzialmente un substrato contenente dU altamente A questo scopo, abbiamo progettato una libreria di acidi nucleici contenenti dU da sequenze di DNA a doppio e singolo filamento., La libreria è costituita da una sequenza permutabile 7mer con un singolo dU nel mezzo (Fig. 5). Permutazione delle regioni di fiancheggiamento 3-nt, 5 ‘- così come 3 ‘ del dU risultati in 4096 sequenze uniche. Nel formato a doppio filamento, sono stati aggiunti un loop e la sequenza complementare al 7mer, portando alla formazione di una struttura a forcina. Ulteriori coppie di basi dG * dC nello stelo del tornante hanno contribuito ad aumentare la temperatura di fusione della struttura del DNA del tornante. Queste coppie di basi sono state aggiunte ai substrati a filamento singolo per mantenere i disegni ssDNA e dsDNA il più simili possibile., Infine, un oligonucleotide 25mer è stato aggiunto al 5 ‘ – fine di ogni disegno al fine di servire come obiettivo di ibridazione. Una figura rappresentativa dei disegni sequenza è mostrato in Fig. 5.
Illustrazione schematica del disegno di sequenza per l’indagine delle dipendenze di sequenza UDG di E. coli su substrati di DNA a singolo filamento (A) e doppio filamento., (B) Al fine di indagare la dipendenza sequenza UDG, un singolo dU è incorporato in un filamento di DNA e racchiuso da 3 basi permutate su ciascun lato. A Il progetto per lo studio della dipendenza dalla sequenza UDG su substrati di DNA a filamento singolo consiste in un DT-linker 15mer, un singolo dU racchiuso da 3 basi permutate su ciascun lato, seguito da una sequenza 5′ 25mer (QC25) che serve come bersaglio per l’ibridazione al suo oligonucleotide complementare marcato con 3′-Cy3 (QC25c). B Per lo studio della dipendenza dalla sequenza UDG su substrati di DNA a doppio filamento, le sequenze sono state progettate per formare un anello a forcina., I trefoli risultanti consistevano in un 15mer DT-linker, uno stelo 11-nt, equivalente al disegno a singolo filamento, contenente la regione variabile affiancata da coppie di basi dG·dC, un ciclo 4-nt seguito dal filo complementare 11nt. All’estremità 5′, è stata sintetizzata una sequenza bersaglio ibridizzabile 25mer (QC25).,
Sebbene l’etichettatura terminale del DNA con un colorante fluorescente sia un metodo conveniente per misurare direttamente l’intensità della fluorescenza, comporta lo svantaggio dell’elevato rumore di fluorescenza che, specialmente sui microarray ad alta densità, rende più difficile l’estrazione e l’interpretazione dei dati. Pertanto, abbiamo deciso di monitorare la reazione di scissione tramite ibridazione alle sequenze immobilizzate., Prima del trattamento con UDG, i substrati di DNA a singolo e doppio filamento sono stati ibridati con l’oligonucleotide complementare 25mer marcato e scansionati per ottenere i valori iniziali di fluorescenza. Quindi, i microarray sono stati esposti a UDG per diversi periodi di tempo. Dopo la seguente scissione del sito AP in condizioni alcaline, gli array sono stati nuovamente ibridati con i loro complementi marcati Cy3. La diminuzione del segnale di fluorescenza dei filamenti di DNA rispetto ai valori di fluorescenza pre-trattamento corrisponde direttamente all’efficienza di scissione., Per i substrati a doppio filamento dopo incubazione UDG per 2 minuti sono state ottenute efficienze di scissione massime di circa il 40% e tassi di scissione leggermente inferiori per i substrati a singolo filamento (Tabella S1). Questo tasso più basso per i single-stranded contraddice studi precedenti che indicano che essi sono scissi più velocemente rispetto ai loro equivalenti double-stranded13,47,48. È interessante notare che le incubazioni enzimatiche molto brevi (<1 min) portano ancora a significative efficienze di scissione (30-35%)., Questi brevi punti di tempo sono particolarmente interessanti in quanto danno chiari suggerimenti di potenziali preferenze di sequenza. Al fine di identificare la dipendenza dalla sequenza nella degradazione del DNA mediata da UDG dal nostro set di 4096 singoli filamenti, ci siamo concentrati sull ‘ 1% (Fig. 6) così come 5% (Fig. S3) del sottoinsieme più e meno scisso di sequenze. I motivi di sequenza rappresentativi generati da tali sottoinsiemi di sequenza sono mostrati in Fig. 6 e nelle Informazioni supplementari.,
Motivi di sequenza rappresentativi per la scissione di uracile mediata da UDG su filamenti di DNA a doppio filamento (A,B) e singolo filamento (C,D). I substrati sono stati incubati con UDG per diversi periodi di tempo che vanno da 5 secondi a 30 minuti (poiché i motivi di scissione mostravano poca o nessuna dipendenza dalla sequenza, solo i 5, 30, 60 e 120 sono stati determinati per ssDNA)., I motivi di sequenza sono stati estratti dalle sequenze 1% (41 di 4096 sequenze) più scisse (A,C) e meno scisse (B,D) della libreria.
Per DNA a doppio filamento (Fig. 6A, B), i risultati mostrano una chiara preferenza di sequenza UDG per le regioni ricche di G/C che fiancheggiano l’uracile. Al contrario, UDG sembra elaborare male substrati a doppio filamento contenenti coppie di basi T·A. I motivi estratti da substrati UDG migliori e più poveri sono in parziale conformità con i dati di letteratura esistenti molto limitati48, 49, 50. Seibert et al., si ipotizza che l’efficienza di E. coli UDG sia correlata al costo energetico della flessione e distorsione del DNA che si verificano nel processo di riconoscimento del danno specifico. In simulazioni di dinamica molecolare e esperimenti di fluorescenza a risoluzione temporale con due sequenze di DNA a doppio filamento contenenti uracile, hanno identificato che le costanti di forza di flessione efficaci sono inferiori se dAs o dTs si trovano adiacenti al nucleotide di uracile, invece di dGs e dCs; suggerendo che le sequenze ricche di dA/dT potrebbero essere piegate più facilmente da UDG e quindi meglio elaborate49., Poiché il DNA a filamento singolo è una forma molto più flessibile di DNA,la sua elaborazione più rapida riportata in letteratura potrebbe essere dovuta al minor costo energetico dei substrati di scissione che sono intrinsecamente più flessibili di dsDNA7,47,49, 51. La curvatura non può, tuttavia, essere un fattore decisivo nella specificità di scissione di UDG di ssDNA, con l’enzima che riconosce e che fende ugualmente bene tutti i substrati, che forse spiega l’assenza di consenso di sequenza in SSDNA du-contenente., È stato tuttavia ipotizzato che gli effetti del contesto di sequenza si estendano ancora al DNA a filamento singolo, e in effetti erano stati osservati per UDG dal virus herpes simplex di tipo 152, ma non è ancora chiaro per UDG umano o E. coli. Slupphaug et al. misurato la specificità della sequenza di UDG umano in 34 contesti di sequenza dsDNA e ipotizzato che dT 3 ‘a dU si traduce sempre in rimozione lenta come ha fatto, un po’ discordante, un alto contenuto di GC50. Eftedal et al. valutato l’efficienza di scissione di entrambi timo vitello e E. coli UDG da 41 sequenze dsDNA e trovato un modello simile., Con il nostro set di sequenze molto più ampio, possiamo concordare che dT 3′ a dU si traduce sempre in una rimozione lenta, ma i nostri dati mostrano chiaramente che dC, e dG in misura minore, 3′ a dU si traduce in una rimozione rapida. Non siamo stati in grado di identificare una significativa dipendenza dalla sequenza per l’escissione dU su ssDNA (Fig. 6 QUATER, D). Va notato che la dipendenza dalla sequenza nei substrati dsDNA è chiara per brevi trattamenti enzimatici (5s, 30s, 60s e 120s), ma lentamente svanisce per un’esposizione UDG più lunga (30min), indicando che tutti i substrati vengono infine scissi quando esposti all’enzima.,
sito di Clivaggio ottimizzazioni
Dal momento che nessuna sequenza significativa dipendenza per il gruppo di distribuzione UNIVERSALE-mediata uracile escissione single-stranded DNA è emerso dai nostri studi e piuttosto moderato scissione di efficienza per singola dU incorporazioni sono stati ottenuti, abbiamo scelto di studio UDG-mediata dU escissione su più single-stranded substrati contenenti varie forme di più dU incorporazioni, puntando per l’individuazione di specifici siti di clivaggio che sono facilmente enzimaticamente accessibili e permettono un rapido ed efficiente strand scissione., La nostra logica è che l’aumento della distanza della sonda dalla superficie dovrebbe fornire una maggiore accessibilità per la scissione, ma questo effetto potrebbe non essere trasferito a distanziatori lunghi (>20-nt)53. Sulla base dei risultati di Fig. 3, ci aspettiamo anche un numero maggiore di incorporazioni dU per portare a una maggiore scissione complessiva, ma ci chiediamo se esiste una densità ottimale di nucleotidi dU all’interno della sezione scindibile del filamento di DNA. Pertanto, abbiamo studiato la scissione di uracile su omopolimeri dU più lunghi (10, 15 e 20mers) e su oligomeri con composizione dU variabile%., La percentuale di dU all’interno dell’oligomero è stata calcolata rispetto agli altri quattro nucleotidi (dA, dC, dG e dT) e ottenuta sperimentalmente eseguendo reazioni di accoppiamento con soluzioni premiscelate di fosforamiditi dU/dA/dC/dG/dT in vari rapporti (0:100, 12:88, 25:75, 50:50 o 100: 0, (v/v) dU: dA / dC / dG / dT). Le sequenze, costruite su linker poli-dT di varie lunghezze (dT1, dT5, dT10 e dT15) e la regione contenente dU sono state quindi terminate con una sequenza target 25mer per scopi di ibridazione come indicato in Fig. 7.,
L’efficienza di scissione di substrati a filamento singolo con UDG o enzimi UTENTE. Si stanno studiando tre parametri: lunghezza del linker (in blu), lunghezza del segmento contenente dU (lunghezza 10, 15 o 20-nt rispettivamente in nero, grigio e grigio chiaro) e contenuto dU (da 0 a 100%, sull’asse x). Tutti i substrati sono terminati all’estremità 5 con una sequenza ibridizzabile 25mer., I microarray corrispondenti sono stati trattati con UDG o enzima UTENTE (5 U, 1 h a 37 °C) e successivamente, nel caso di trattamento UDG, con EDA/EtOH per 2 h a r.t. L’efficienza di scissione corrisponde alla perdita di fluorescenza di ibridazione dopo trattamento enzimatico e rispetto ai controlli dU 0%.
Dopo la sintesi, il 25mer è stato ibridato al suo oligonucleotide complementare marcato con 5′-Cy3 e il microarray è stato esposto a UDG per 1 ora., Quindi, la scissione del sito abasico è stata eseguita in condizioni alcaline, seguita da una riibridizzazione finale. In parallelo, abbiamo anche eseguito il test di scissione con l’enzima UTENTE, che in questo caso elimina la necessità di un’ulteriore procedura di scissione del sito abasico.
Per il test enzimatico con UDG seguito da scissione del sito abasico in condizioni alcaline (Fig. 7, a sinistra), abbiamo registrato efficienze di scissione che vanno dal 4% fino all ‘ 80% e con tendenze chiare emergenti., Ad esempio, l’efficienza di scissione aumenta significativamente con l’aumentare della lunghezza della regione contenente dU, nell’ordine 10mer > 15mer > 20mer, con un massimo di ~50% di scissione raggiungibile per una regione di 10mer dU e 80% massimo per la regione di 20mer dU. Allo stesso modo, i linker più lunghi si traducono in un tasso di scissione generale più elevato. Queste osservazioni indicano che le sequenze più lunghe sono meglio riconosciute e le corrispondenti basi di uracile meglio asportate da UDG, che a sua volta suggerisce una maggiore accessibilità dei substrati più lunghi da parte dell’enzima., L’efficienza di scissione è anche influenzata dalla quantità di nucleotidi dU all’interno della parte scindibile del substrato. Infatti, gli omopolimeri di uracile (100% dU) sono quasi sempre meno scissi dei loro congeneri con nucleotidi dU intervallati, e questo effetto è particolarmente chiaro quando i substrati sono sintetizzati su un breve linker T1. D’altra parte, l’aumento del contenuto di dU da 12 a 50% è soddisfatto con l’aumento dell’efficienza di scissione, con 50% dU che sembra essere la quantità ottimale., Pertanto, nelle nostre condizioni sperimentali, la scissione mediata da UDG è stata la più efficiente sui substrati più lunghi in cui metà dei nucleotidi nella parte scindibile sono dU (efficienza di scissione dell ‘ 80%). Questa tendenza, così come i dati mostrati in Fig. 3, suggerisce che l’UDG può riconoscere e legarsi a più incorporazioni dU, purché le DU siano separate da nucleotidi di DNA canonici.
Mentre gli omopolimeri corti sono generalmente noti per essere substrati UDG poveri, ci aspettavamo anche di osservare bassi tassi di scissione per le regioni clivabili 20mer poiché è improbabile che tali substrati si trovino nel DNA., In vivo, le basi di uracile si verificano principalmente nei filamenti di DNA a causa di misincorporazione durante la replicazione o a causa della deaminazione8,9 ed è improbabile che entrambi i processi si verifichino a una frequenza così elevata da formare omopolimeri. Tuttavia, sono state ottenute efficienze di scissione da moderate a elevate di circa il 60% su omopolimeri DU lunghi 20mer, ma resta da valutare se tali omopolimeri siano trattati più lentamente rispetto a substrati con un contenuto dU inferiore.
Trattare una libreria di array di DNA simile con il sistema enzimatico UTENTE (Fig., 7, a destra) porta a una scissione soddisfacente dei substrati a filamento singolo, con tendenze di scissione in qualche modo paragonabili al caso UDG, ma con alcune eccezioni notevoli. In primo luogo, la più alta efficienza di scissione è inferiore a quella del sistema UDG/EDA (55% contro 80%, rispettivamente), che può essere attribuita a un trattamento più lento dei siti abasici con endonucleasi VIII rispetto a un trattamento di base comune con EDA., In secondo luogo, sembra esserci una discriminazione di lunghezza più debole nella regione fendibile rispetto a UDG/EDA, con solo il 20-25% di differenza al massimo tra le regioni contenenti dU corte (10-nt) e lunghe (20-nt), quando il solo trattamento UDG ha portato a grandi variazioni nell’efficienza di scissione degli stessi 10 e 20mers (fino al 50% di differenza). Ancora una volta, questo effetto potrebbe essere dovuto a differenze nella velocità di elaborazione dei siti AP. Infine, gli omopolimeri dU sembrano essere degradati nella stessa misura, indipendentemente dalla lunghezza del linker o del substrato., Questa mancanza di discriminazione nel caso dell’enzima dell’UTENTE e rispetto ai dati di scissione mediati da UDG suggerisce che l’esistenza di più siti AP consecutivi è il fattore limitante nella rimozione enzimatica dei siti AP.
Per riassumere, nelle nostre mani, abbiamo scoperto che le migliori efficienze di scissione possono essere raggiunte con la scissione mediata da UDG seguita dal trattamento EDA su substrati contenenti uracile più lunghi e non omopolimerici. In tal modo, sequenze a filamento singolo contenenti il 50% di dU possono essere scisse in modo efficiente, anche se in due passaggi., Un breve trattamento in una sola fase con il cocktail enzimatico dell’UTENTE può anche convenientemente fendere fino al 50% di singoli filamenti contenenti dU in un’ora, tuttavia, il potere discriminante apparentemente inferiore di questo particolare trattamento enzimatico può essere meno utile quando è richiesta una scissione preferenziale.