Le nucleasi CRISPR/Cas9 sono stati ampiamente applicati per l’editing del genoma in vari organismi. Le nucleasi Cas9 complessate con un RNA guida (Cas9-gRNA) trovano i loro obiettivi scansionando e interrogando il DNA genomico per sequenze complementari al gRNA., Il riconoscimento della sequenza bersaglio del DNA richiede un breve motivo adiacente protospacer (PAM) situato al di fuori di questa sequenza. Dato che l’efficienza della posizione del bersaglio può dipendere dalla forza delle interazioni che promuovono il riconoscimento del bersaglio, qui abbiamo cercato di confrontare le affinità delle diverse nucleasi Cas9 per le loro sequenze PAM affini., A tal fine, abbiamo misurato le affinità delle nucleasi Cas9 da Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus e Francisella novicida complessate con RNA guida (gRNAs) (SpCas9-gRNA, SaCas9-gRNA e FnCas9-gRNA, rispettivamente) e di tre varianti ingegnerizzate di SpCas9-gRNA con specificità PAM alterate per sonde a DNA brevi contenenti PAM. Abbiamo usato un test ” beacon “che misura le affinità relative delle sonde del DNA determinando la loro capacità di influenzare in modo competitivo il tasso di legame Cas9-gRNA ai derivati del DNA bersaglio etichettati in modo fluorescente chiamati” Cas9 beacons.,”Abbiamo osservato differenze significative nelle affinità per le sequenze PAM affini tra gli enzimi Cas9 studiati. Le affinità relative di SpCas9-gRNA e le sue varianti ingegnerizzate per PAM canoniche e subottimali sono correlate con precedenti risultati sull’efficienza di queste sequenze PAM nell’editing del genoma. Questi risultati suggeriscono che l’alta affinità di una nucleasi Cas9 per il suo PAM affine promuove una maggiore efficienza di editing del genoma.