Tecniche per l’estrazione e l’isolamento di prodotti naturali: una revisione completa

I componenti l’estratto metodi di cui sopra sono complesse e contengono una varietà di prodotti naturali che necessitano di ulteriore separazione e purificazione per ottenere la frazione attiva o prodotti naturali. La separazione dipende dalla differenza fisica o chimica del singolo prodotto naturale., La cromatografia, in particolare la cromatografia a colonna, è il metodo principale utilizzato per ottenere prodotti naturali puri da una miscela complessa.

Separazione basata sulle proprietà di adsorbimento

La cromatografia a colonna di adsorbimento è ampiamente utilizzata per la separazione di prodotti naturali, specialmente nella fase iniziale di separazione, grazie alla sua semplicità, all’elevata capacità e al basso costo di adsorbenti come gel di silice e resine macroporose. La separazione si basa sulle differenze tra le affinità di adsorbimento dei prodotti naturali per la superficie degli adsorbenti., La selezione degli adsorbenti (fase stazionaria) così come la fase mobile è fondamentale per ottenere una buona separazione dei prodotti naturali, massimizzare il recupero dei composti bersaglio ed evitare l’assorbimento irreversibile dei composti bersaglio sugli adsorbenti.

Il gel di silice è l’adsorbente più utilizzato nell’indagine fitochimica. È stato stimato che quasi il 90% della separazione fitochimica (scala preparativa) era basata su gel di silice. Il gel di silice è un assorbente polare con gruppi di silanolo. Le molecole vengono trattenute dal gel di silice attraverso legami idrogeno e interazioni dipolo-dipolo., Pertanto, i prodotti naturali polari vengono trattenuti più a lungo nelle colonne di gel di silice rispetto a quelli non polari. A volte, alcuni prodotti naturali polari potrebbero subire un chemisorbimento irreversibile. La disattivazione del gel di silice aggiungendo acqua prima dell’uso o utilizzando una fase mobile contenente acqua indebolirà l’adsorbimento. Grave tailing può verificarsi quando si separano alcaloidi su gel di silice, e l’aggiunta di una piccola quantità di ammoniaca o ammine organiche come trietilammina può ridurre il tailing., Dodici alcaloidi appartenenti al gruppo metil chanofruticosinate tra cui sei nuovi alcaloidi, prunifolines A-F (68-73, Fig. 11), sono stati ottenuti dalla foglia di Kopsia arborea mediante cromatografia iniziale a colonna di gel di silice utilizzando gradiente MeOH–CHCl3 come fase mobile seguita da TLC centrifugo utilizzando sistemi ET2O–esano saturi di ammoniaca o EtOAc/esano come eluente .

Allumina (ossido di alluminio) è un forte polar adsorbente utilizzato per la separazione dei prodotti naturali, soprattutto nella separazione di alcaloidi. Il forte campo positivo di Al3+ e i siti di base in allumina che interessano composti facilmente polarizzati portano all’adsorbimento su allumina che è diverso da quello sul gel di silice., L’applicazione dell’allumina nella separazione dei prodotti naturali è diminuita significativamente negli ultimi anni perché può catalizzare la disidratazione, la decomposizione o l’isomerizzazione durante la separazione. Zhang e Su hanno riportato un protocollo cromatografico che utilizza l’allumina di base per separare il taxol (74, Fig. 11) dall’estratto di colture di callo cuspidato Taxus e trovato il recupero di taxol era superiore al 160%. Hanno scoperto che l’aumento di taxol proveniva dall’isomerizzazione di 7-epi-taxol (75) catalizzato dall’allumina., Si è anche riscontrato che una piccola quantità di taxolo potrebbe essere scomposta in baccatina III (76) e 10-deacetilbaccatina III (77) nella colonna di allumina . Ulteriori indagini sulla separazione di taxol su allumina acida, neutra e basica hanno indicato che il souci di Lewis e i nuclei di attività di base sulla superficie dell’allumina hanno indotto l’isomerizzazione di 7-epi-taxol a taxol .

Le strutture delle poliammidi utilizzate nella cromatografia contengono sia gruppi acrilici che ammidici., L’interazione idrofobica e/o legame idrogeno si verificherà nella cromatografia della colonna di poliammide a seconda della composizione della fase mobile. Quando solventi polari come solventi acquosi vengono utilizzati come fase mobile, le poliammidi agiscono come fase stazionaria non polare e il comportamento della cromatografia è simile alla cromatografia a fase inversa. Al contrario, le poliammidi agiscono come fase stazionaria polare e il comportamento della cromatografia è simile alla normale cromatografia di fase., La cromatografia a colonna in poliammide è uno strumento convenzionale per la separazione di polifenoli naturali tra cui antrachinoni, acidi fenolici e flavonoidi, i cui meccanismi sono attribuiti alla formazione di legami idrogeno tra assorbenti poliammidici, fase mobile e composti bersaglio. Gao et al. ha studiato il comportamento cromatografico dei polifenoli tra cui acidi fenolici e flavonoidi sulla colonna di poliammide. Si è constatato che la poliammide ha funzionato come un accettore di legame idrogeno, e il numero di idrossili fenolici e le loro posizioni nella molecola influenzato la forza di adsorbimento ., Oltre ai polifenoli, è stata riportata anche la separazione di altri tipi di prodotti naturali mediante cromatografia a colonna in poliammide. Le saponine totali di Kuqingcha possono essere arricchite dalla cromatografia a colonna in poliammide, che ha ridotto significativamente la pressione sistolica del ratto SHR . Utilizzando una miscela di diclorometano e metanolo in un gradiente come eluente, i sette principali alcaloidi isochinoline in Coptidis Rhizoma tra cui berberina (39), coptisina (40), palmatina (41), jatrorrhizina (42), columbamina (78), groenlandicina (79) (Fig. 4), e magnoflorine (80, Fig., 11) sono stati separati in cromatografia a colonna in poliammide in una fase .

Le resine macroporose adsorbenti sono adsorbenti polimerici con strutture macroporose ma senza gruppi di scambio ionico che possono adsorbire selettivamente quasi tutti i tipi di prodotti naturali. Sono stati ampiamente utilizzati sia come sistema autonomo, sia come parte di un processo di pretrattamento per rimuovere le impurità o arricchire i composti bersaglio grazie ai loro vantaggi, che includono un’elevata capacità adsorbente, costi relativamente bassi, facile rigenerazione e facile scalabilità., I meccanismi adsorbenti delle resine macroporose adsorbenti includono forze elettrostatiche, legame idrogeno, formazione complessa e azioni di setacciatura delle dimensioni tra le resine e i prodotti naturali in soluzione. Superficie, diametro dei pori e polarità sono i fattori chiave che influenzano la capacità delle resine . 20 (S)-protopanaxatriol saponine (PTS) (81) e 20 (S)-protopanaxadiol saponine (PDS) (82, Fig. 11) sono conosciuti come due componenti bioattivi principali nella radice di Panax notoginseng., PTS e PDS sono stati separati con successo con soluzioni acquose di etanolo al 30 e all ‘ 80% (v/v) dalla colonna di resina macroporosa D101, rispettivamente. I comportamenti cromatografici di PDS e PTS erano vicini alla cromatografia a fase inversa quando si confrontavano i profili cromatografici della cromatografia a colonna di resina macroporosa con il cromatogramma HPLC su una colonna Zorbax SB-C18 . Recentemente, Meng et al. ottenuto le saponine totali di Panacis Japonici Rhizoma (PJRS) utilizzando resina macroporosa D101., Il contenuto delle quattro principali saponine, chikusetsusaponins V (55), IV (56) e IVa (57), e pseudoginsenoside RT1 (58) (Fig. 8), nel PJRS ottenuto era superiore al 73%. Il PJRS è servito come riferimento standard per il controllo di qualità di Panacis Japonici Rhizoma . Alcuni ricercatori hanno ipotizzato che il principale meccanismo di adsorbimento tra resine macroporose e polifenoli fosse associato alla formazione di legame idrogeno tra l’atomo di ossigeno del legame etere della resina e l’atomo di idrogeno del gruppo idrossile fenolico del fenolo., La forza di interazione di legame idrogeno è stata significativamente influenzata dal valore di pH della soluzione .

Il nitrato d’argento è un altro utile supporto solido nella separazione dei prodotti naturali. Questi prodotti naturali contenenti gli elettroni π interagiscono reversibilmente con gli ioni d’argento per formare complessi polari. Maggiore è il numero di doppi legami o aromaticità del prodotto naturale, più forte è la complessazione. Il nitrato d’argento è tipicamente impregnato su gel di silice (SNIS) o allumina per la separazione. Diversi gruppi di ricerca hanno riportato la separazione degli acidi grassi su SNIS . Wang et al., riportato l’isolamento dello zingiberene dall’oleoresina dello zenzero mediante cromatografia a colonna SNIS . Una coppia di isomeri, acido brasiliensico (83, Fig. 11) e acido isobrasiliensico (84), sono stati separati da Calophyllum brasiliense da Lemos et al. su una colonna SNIS . Alcuni gruppi di ricerca hanno anche applicato il nitrato d’argento nel sistema a due fasi nella cromatografia controcorrente ad alta velocità (HSCCC) per migliorare la separazione. Xanthochymol (85) e guttiferone E (86) sono una coppia di legame π isomeri benzofenone da Garcinia xanthochymus da AgNO3-HSCCC., L’ordine di eluizione degli isomeri del legame π in questa separazione AgNO3-HSCCC è il legame π interno (precedente) < terminale, che è identico a quello osservato dalla cromatografia a colonna SNIS .

Separazione basata sul coefficiente di partizione

La cromatografia di partizione (PC) segue il principio di estrazione liquido–liquido basato sulla relativa solubilità in due diversi liquidi immiscibili. Nella fase iniziale, una fase liquida è stata rivestita in una matrice solida (gel di silice, carbonio, cellulosa, ecc.) come fase stazionaria e un’altra fase liquida è stata impiegata come fase mobile., Lo svantaggio di una fase stazionaria facilmente rimossa e risultati irripetibili ha portato a questo tipo di PC raramente utilizzato oggi. La fase legata, in cui la fase stazionaria liquida è chimicamente legata al supporto inerte, che viene utilizzata come fase stazionaria supera tali inconvenienti. Alchil disponibili in commercio come C8 e C18, aril, ciano e ammino silani sostituiti sono spesso utilizzati come fasi legate, che sono ampiamente utilizzati per separare una varietà di prodotti naturali, soprattutto nella fase di purificazione finale.

Tre punti (notoginsenoside R1 (87) (Fig., 11), ginsenosidi Rg1 (55) (Fig. 8) e Re (88) (Fig. 11)) e due PDS (Fig. 3) sono stati ben separati in una colonna C18 utilizzando il sistema EtOH-H2O come fase mobile . Una nuova fase stazionaria di silice a base di poliacrilammide è stata sintetizzata da Cai et al. ed è stato applicato con successo nella separazione di galactooligosaccharides e saponins di polyphylla di Parigi con EtOH-H2O come la fase mobile .

La cromatografia controcorrente (CCC) è una specie di PC che trattiene la fase stazionaria liquida per gravità o forza centrifuga., CCC è stato raramente utilizzato nelle fasi iniziali a causa della sua scarsa ritenzione stazionaria, del lungo tempo di separazione e del processo ad alta intensità di lavoro. CCC è stato notevolmente migliorato nel 1980, tuttavia, quando CCC moderna, tra cui HSCCC e cromatografia partizione centrifuga (CPC), sono stati sviluppati. I sistemi CCC idrodinamici come HSCCC hanno un movimento di rotazione planetario attorno a due assi rotanti senza guarnizioni rotanti, che offre un processo a bassa caduta di pressione. CCC idrostatico, ad esempio,, cromatografia centrifuga della divisione, usa soltanto un asse girante ed ha una serie di camere d’interconnessione per intrappolare la fase stazionaria che offre una più alta conservazione della fase stazionaria ed una più alta pressione di sistema che quella di HSCCC. L’elevata pressione del sistema in CPC impedisce il miglioramento della risoluzione aumentando la lunghezza della colonna. High performance CCC (HPCCC) rappresenta una nuova generazione di CCC idrodinamici e funziona allo stesso modo di HSCCC, ma con un livello g molto più alto., Gli strumenti HPCCC generano più di 240 g, mentre le prime apparecchiature HSCCC davano livelli g inferiori a 80 g. HPCCC riduce il tempo di separazione a meno di un’ora rispetto a diverse ore in HSCCC precedente e può raggiungere almeno dieci volte il throughput di uno strumento HSCCC ., Rispetto al metodo convenzionale della separazione della colonna facendo uso di una fase stazionaria solida, sia i sistemi idrostatici che idrodinamici del CCC offrono alcuni vantaggi compreso l’eliminazione dell’adsorbimento irreversibile e del tailing del picco, l’alta capacità di carico, l’alto recupero del campione, il rischio minimo di denaturazione del campione ed il consumo basso del solvente. La limitazione di CCC è che separa solo i composti in una finestra di polarità relativamente stretta. Negli ultimi 20 anni, HSCCC, HPCCC e CPC hanno attirato grande attenzione nella scienza della separazione e sono stati ampiamente utilizzati nella separazione di prodotti naturali., Tang et al. sviluppato un metodo HSCCC utilizzando un sistema solvente a due fasi comprendente acetato di etile-n-butanolo-etanolo-acqua (4:2:1.5:8.5, v/v/v/v) per separare sei flavoni C-glicosidi (89-94, Fig. 12), tra cui due nuovi composti da Lophatherum gracile . HSCCC, HPCCC e CPC inoltre sono stati applicati con successo nella separazione di olio volatile, che è difficile da separare via la cromatografia convenzionale della colonna., Sei composti volatili (curdione (95), curcumol (96), germacrone (97), curzerene (98), 1,8-cineolo (99) e β-elemene (100)) sono stati isolati da parte di CPC dall’olio essenziale di Curcuma wenyujin utilizzando un nonaqueous due fasi solvente composto di etere di petrolio–acetonitrile–acetone (4:3:1 v/v/v) ., Quattro grandi sesquiterpenoidi (ar-turmerone (101), α-turmerone (102), β-turmerone (103), ed e-atlantone (104)) con strutture simili sono state separate dall’olio essenziale di Curcuma longa in un unico HSCCC eseguito utilizzando un due-fase solvente sistema composto di n-eptano–acetato di etile–acetonitrile–acqua (9.5/0.5/9/1, v/v) e ogni composto ottenuto oltre il 98% di purezza . Linalolo (105), terpinen-4-ol (106), α-terpineolo (107), p-anisaldeide (108), anetolo (109) e foeniculina (110) sono stati isolati con successo dall’olio essenziale di Pimpinella anisum mediante HPCCC utilizzando un’eluizione graduale a gradiente ., Li et al. ha sviluppato un metodo CPC per la separazione dell’alcol di patchouli (111) con un sistema solvente etere–acetonitrile non acquoso (1:1, v/v). Più di 2 g di alcol patchouli con purezza superiore al 98% sono stati isolati da 12,5 g di olio essenziale su una colonna da 240 ml . La colonna del grande volume (parecchi litri) è stata adottata in CCC idrostatico commerciale ed in attrezzatura idrodinamica del CCC per la separazione della scala industriale/del pilota. Pochi rapporti potrebbero essere ottenuti a causa della riservatezza commerciale. È difficile giudicare se il CCC idrostatico o idrodinamico sia migliore per le applicazioni industriali., Gli utenti possono selezionare diversi tipi di strumenti CCC per scopi diversi. Quando la fase stazionaria è scarsamente trattenuta nel CCC idrodinamico a causa dell’elevata viscosità e delle piccole differenze di densità tra le fasi mobili e stazionarie, il CCC idrostatico è più pratico del CCC idrodinamico perché la ritenzione della fase stazionaria del CCC idrostatico è meno sensibile alle proprietà fisiche dei sistemi liquidi e avrà una maggiore ritenzione della fase stazionaria., Quando la fase stazionaria è ben mantenuta nel CCC idrodinamico, si otterrà una maggiore efficienza di separazione dal CCC idrodinamico rispetto al CCC idrostatico con lo stesso sistema liquido e volumi di colonna simili perché il CCC idrostatico ha un’efficienza di partizione relativamente bassa a causa di un grado limitato di miscelazione e il sistema idrodinamico fornisce una miscelazione efficiente per ottenere

Separazione basato sulla dimensione molecolare

La separazione di prodotti naturali mediante filtrazione su membrana (MF) o cromatografia di gel filtrazione (GFC) si basa sulla loro dimensioni molecolari.

Filtrazione a membrana (MF)

In MF, la membrana semipermeabile consente alle molecole più piccole di passare attraverso e trattiene le molecole più grandi., MF di prodotti naturali potrebbe essere caratterizzato come microfiltrazione, ultrafiltrazione e nanofiltrazione in base alla dimensione dei pori della membrana applicata.

La filtrazione a membrana è stata un potente strumento per la concentrazione, la chiarificazione e la rimozione delle impurità in laboratorio, così come nell’industria alimentare e farmaceutica. Il contenuto di fenoli totali (338%), acido clorogenico (66) (Fig. 10) (483%), teobromina (112, Fig., 13) (323%), caffeina (113) (251%), tannini condensati (278%) e saponine (211%) nell’estratto acquoso di Ilex paraguariensis sono stati significativamente aumentati dalla nanofiltrazione . La filtrazione a membrana di accoppiamento viene applicata quando una singola fase di filtrazione a membrana non è soddisfacente. Una sequenza di microfiltrazione, ultrafiltrazione e nanofiltrazione è stata applicata nell’isolamento di componenti bioattivi dall’estratto di foglie di olivo. La microfiltrazione seguita dall’ultrafiltrazione ha rimosso le impurità più grandi di 5 kDa., La nanofiltrazione ha recuperato i polifenoli e i flavonoidi antiossidanti e antibatterici e il contenuto del componente principale, oleuropeina (114), nel retentato di nanofiltrazione è stato concentrato circa dieci volte .

cromatografia di Gel filtrazione (GFC)

cromatografia di Gel filtrazione è anche conosciuta come la cromatografia a permeazione di gel o cromatografia di esclusione di formato., Le piccole molecole hanno un tempo di ritenzione più lungo in GFC rispetto alle grandi molecole.

Sephadex è formato da destrano reticolato e i tipi G di Sephadex sono stati utilizzati per la separazione di composti idrofili come peptidi , oligosaccaridi e polisaccaridi .

Sephadex LH20, un derivato idrossipropilato di Sephadex G25, ha natura sia idrofobica che idrofila. Un meccanismo di adsorbimento è stato anche coinvolto nella separazione utilizzando Sephadex LH-20. Sephadex LH-20 può essere utilizzato per la separazione di un’ampia varietà di prodotti naturali in un sistema solvente acquoso o non acquoso., Gli oligosaccaridi di arabinoxilano feruloilati del grano intermedio per cereali perenni sono stati ben separati da Sephadex LH-20 utilizzando acqua al 100% come fase mobile . Tre nuovi diterpeni pirimidinici, axistatins 1-3 (115-117, Fig. 14) insieme a tre formamidi noti (118-120) sono stati isolati dalla frazione attiva anti-cancro CH2Cl2 di Agelas axifera su colonne Sephadex LH-20 con una serie di sistemi solventi , seguiti da purificazione utilizzando Prep-HPLC .