pulmonale evaluatie. Longfunctietesten (PFT) werden uitgevoerd met een Brentwood Spirometer in ons kantoor. Sommige patiënten waren elders getest.
Immuuntesten. Tests werden uitgevoerd in Immunosciences Laboratories onder leiding van A. Wojdani, Ph. D.. Gezien het belang van deze tests in het kader van deze evaluatie wordt de methodologie in detail beschreven.,
preparaat van formaldehyde-humaan serumalbumine (F-HSA) en Formaldehyde-boviene serumalbumine (F-BSA) conjugaten:
elektroforetische en immuno-elektroforetische vergelijking van HSA, BSA met F-HSA en F-BSA werd uitgevoerd om het voorkomen van conjugatie te bepalen. Conjugatie werd aangetoond door veranderde mobiliteit van F-HSA, F-BSA wanneer het werd vergeleken met respectievelijk HSA of BSA. Bovendien werd het aantal vrije amino-add-groepen aanwezig in de F-HSA of F-BSA bepaald door de methode van Snyder en Sobocinski (1975) en werd gebruikt om de hoeveelheid substitutie te bepalen., Het aantal aan formaldehyde gebonden aminogroepen was 26 voor HSA en 31 voor BSA. In deze berekening werd de vorming van intermoleculaire cross-linking overwogen.
preparaat van tolueendiisocyanaat-humaan serumalbumine (TDI-HSA) en boviene serumalbumine (TDI-BSA) conjugaten:
dit preparaat was vergelijkbaar met de methoden van Dewar en Baur (1982). Volgens deze methode werd 1g HSA of 1G BSA opgelost in 100 ml van een bufferoplossing met kaliumchloride (0,05 mol/l), natriumboraat (0,05 mol/l), PH 9,4 en gekoeld tot 4 C. dioxaan (10 ml) met 0.,Vervolgens werd 15 ml tolueendiisocyanaat druppelsgewijs toegevoegd onder roeren gedurende een periode van 3 uur, gevolgd door toevoeging van 2 ml ethanolamine, centrifugatie, dialysefiltratie en lyofilisatie. Vergelijkbaar met F-HSA en F-BSA, werd conjugatie bevestigd door elektroforese en bepaling van vrije aminogroepen aanwezig in het conjugaat. Het aantal aan TDI gebonden aminogroepen was 37 voor HSA en 43 voor BSA. Daarnaast werd spectrografische analyse van het conjugaat uitgevoerd volgens Zeiss et. al. (1980)., Er was een duidelijke toename van de absorptie van 230 naar 260 nm, wat erop wees dat TDI covalent verbonden was met de eiwitdrager. Deze toename van de absorptie kwam overeen met de bepaling van de NH2-groep van slechts 76% voor HSA en 81% voor BSA
preparaat van trimellitisch anhydride-humaan serumalbumine (TMA-HSA) en Trimellitisch anhydride boviene serumalbumine (TMA-BSA):
om deze conjugaten 25 mg te bereiden. van TMA werd opgelost in 0,5 ml dioxaan en druppelsgewijs toegevoegd aan 25 mg HSA of BSA opgelost in 5 ml koude 7% NaHCO3 in water., Na 60 minuten roeren bij 4 C werden de conjugaten gedialyseerd tegen vier veranderingen van 0,1 M NaHCO3 en één verandering van buffer. Tenslotte werden de conjugaten gefilterd en op -20 C gehouden tot ze gebruikt werden. Od analyses van TMA-HSA, en TMA-BSA werden gedaan om het aantal TMA residuen te bepalen verbonden aan de overeenkomstige dragerproteã ne. De concentratie van het dragereiwit werd omgezet in molaire concentratie met het molecuulgewicht van HSA en BSA. Uit de verhouding van de molaire concentratie van het TMA ligand en de eiwitdrager werd de verhouding van TMA-residuen per molecules van drager berekend., TMA-HSA werd geschat op 5 TMA residuen per HSA moleculen en voor TMA-BSA zeven residuen per albumine molecule (Pien et al., 1988).
bereiding van ftaalzuuranhydride-humaan serumalbumine (PA-HSA) en ftaalzuuranhydride-boviene serumalbumine (PA-BSA) conjugaten:
deze haptenconjugaten werden bereid door 75 mg PA toe te voegen aan een gekoelde oplossing van 300 mg HSA of BSA in 100 ml H2o. het reactiemengsel werd ‘ s nachts geroerd en gedialyseerd tegen 0,1 M PBS met tubings met een cut-off van 8000 dalton. Met behulp van de methode van Zeiss et. al. (1977) de molaire verhoudingen werden berekend., De molaire verhoudingen werden vastgesteld op 22/28 voor PA / HSA en 25/30 voor PA/BSA.
preparaat van benzeenring HSA (B-HSA) en benzeenring BSA (B-BSA) conjugaten:
voor deze preparaten, 40 mg. P-aminobenzoëzuur werd opgelost in 2 ml 1 N HCL en gekoeld door onderdompeling in een ijsbad. Een koude oplossing van 14 mg/ml werd druppelsgewijs toegevoegd. Na elke toevoeging werd het mengsel 30 seconden geroerd. Tegelijkertijd werd één gram HSA of BSA opgelost in boorzuur 0,16 M natriumchloride (0-15 m) buffer PH 9,0 (PH werd verhoogd met NaOH)., De bekers met albumineoplossingen werden omgeven door een ijsbad op magneetroerder. De oplossing van diazoniumzout werd druppelsgewijs toegevoegd, onder snel roeren aan de koude eiwitoplossing. Na toevoeging van elke daling wordt de PH aangepast tot 9,0 tot 9,5 met één normale NaOH. Nadat alle oplossing was toegevoegd, werd de reactie met langzaam roeren gedurende ten minste een uur voortgezet met verdere toevoegingen van de NaOH-oplossing en waarbij de PH op een bereik van 9,0 tot 9,5 werd gehouden., Unreacted kleine molecules werden verwijderd door uitgebreide dialyse of door passage door een kolom van sephadex G-25 in de koude ruimte, met een isotone zoutoplossing als eluting buffer. OD-analyses van oranje kleurontwikkeling van B-HSA en B-BSA werden uitgevoerd om het aantal B-residuen te bepalen dat gekoppeld is aan het overeenkomstige dragereiwit. De hoeveelheid B-substitutie voor HSA was ongeveer 41 en voor BSA 53 (Migrdichian, 1957).
bepaling van antilichamen:
specifieke antilichamen tegen F-HSA, TDI-HSA, TMA-HSA, PA-HSA en B-HSA werden geanalyseerd met een niet-competitieve ELISA-assay., Putten van microtiterplaten (Dynatech, Alexandria, VA) werden gecoat met 100 1 antigeenoplossingen (100 g/ml) in 0,1 m PBS PH 7,2 ‘ s nachts bij 4 C. platen werden 4 keer gewassen met 0,1 m PBS bevattende 0,05% tween 20 tussen elke stap. Vrije absorptieplaatsen werden geblokkeerd met 2% protease-vrij runderserumalbumine bij kamertemperatuur gedurende 4 uur en bewaard bij -20 ° C tot het werd gebruikt.,
Analytische Procedure:
De procedure de volgende: (1) het wassen van vier keer, (2) toevoeging van 100 1 verdund serum (1:2 voor IgE en 1:100 voor IgM en IgG) in PBS-tween-20 met 1% BSA (3) incubatie gedurende 4 uur bij 20 ° C, gevolgd door het wassen van 4 keer, (4) toevoeging van 100 1 van een optimale verdunning van alkalische fosfatase gelabeld affiniteit gezuiverd geit-anti-human IgE ( ) (1:200), IgM (1:500) en anti-IgG (1:1000), gekocht van KPI ‘ s (Maryland) (5) incubatie gedurende 120 minuten bij 20 C, (6) het wassen van 6 keer, (7) 100 1 P-nitrofenyl fosfaat (Sigma Chemical Co.,) (8) incubatie gedurende 60 minuten bij 20 C (9) toevoeging van 50 1 van 3 n natriumhydroxideoplossing en (10) dubbele aflezing. De resultaten werden berekend op basis van de absorptie van duplicaatmonsters van 405 nm met behulp van een microtiterlezer. Alle monsters werden gelezen tegen een HSA-antigeen als een controle van binding die niet specifiek is voor F-HSA, TDI-HSA, TMA-HSA, PA-HSA en B-HSA. De resultaten werden uitgedrukt als titer. Titer is de laatste verdunning van het serum die tweemaal de HSA-controle absorbeert.,
onderzoek naar specificiteit en Kruisremming:
voor de bepaling van de antilichaamspecificiteit werd een kruisremmingsonderzoek uitgevoerd. Positieve sera voor elk hapten-eiwitconjugaat werden uitgevoerd na geschikte incubatie en precipitatie met vertienvoudigde verhogingen van hapten-gebonden HSA of BSA als inhibitors om het bereik van antilichaam tegen antigeen overmaat te dekken. Dit bereik lag tussen 50 g en 1000 g voor hapten-BSA en 80 g en 1000 g voor hapten-RSA., Na incubatie bij 37 C en verwijdering van precipitaat door centrifugering, werden de monsters van voor en na kruisremmingonderzoek vervolgens op platen geplaatst met putjes die met het specifieke conjugaat zijn bedekt. De volgende stappen werden gevolgd zoals hierboven beschreven voor het ELISA-onderzoek.
IgG-en IgM-antilichaambinding aan verschillende conjugaten werd geremd door hapten-HSA of hapten-BSA van 36-85%. Bij een bepaalde concentratie remde zowel hapten-HSA als hapten-BSA het antilichaamniveau op vergelijkbare manieren.,
partiële remming van IgE-antilichaambinding aan verschillende hapten-conjugaten werd waargenomen bij pre-incubatie van serum met hapten-HSA of hapten-BSA. Deze onvolledige observatie van remming van IgE antilichaam was voornamelijk gerelateerd aan de niet-beschikbaarheid van serum met hoge ige titers tegen verschillende chemicaliën in ons laboratorium.,
bepaling van normale concentraties antilichamen (controles):
op basis van de bovenstaande procedures werden 160 bloeddonormonsters van gezonde personen, van beide geslachten, tussen de leeftijd van 22-55, onderzocht op concentraties antilichamen tegen F-HSA, TD-HSA, TMA-HSA, PA-HSA en B-HSA. De gemiddelde titer was 1: 800 400 voor IgG, 1: 3200 1600 voor IgM en 1:8 4 voor IgE. Zo worden in ons laboratorium titers groter dan 1:1600 voor IgG, 1:6400 voor IgM en 1:16 voor IgE als positief beschouwd.,
bij een bepaalde patiënt werden stijgingen of dalingen in antilichaamtiters door meer dan één verdunning als significant beschouwd (zie tabellen).
lymfocyten Subset telling:
een enkele laser flow cytometer (Epics Profile: Coulter Epics, Inc., Hialeah, FL) die onderscheid maakt tussen voorwaartse en rechte hoek lichtverstrooiing, evenals twee kleuren, werd gebruikt met een softwarepakket (Quad Stat: Coulter). Mononucleaire celpopulaties werden bepaald door twee-kleuren directe immunofluorescentie met behulp van een volbloed kleuring techniek met de juiste monoclonal antilichaam en stroom cytometrie (Fletcher et al.,, 1989) de volgende paren fluoresceïne isothiocyanaat (FITC), of phycoerythrin (PE)-geconjugeerde monoklonale antilichamen (Coulter immunologie) werden geselecteerd: T11-RDI/B4-FITC, T4-RDI/T8-FITC, T3-FITC/NKH-1-RDI en T11-FITC/Tal-PE Voor de bepaling van T-cel/B-cel, T-helper/T-suppressor, NKHT3+ /NKHY3 en voor alternatieve pathway van lymfocytenactivatie respectievelijk.
om lymfocytenmarkers te controleren, werden BBT-kaarten vastgesteld op de lymfocytenpopulatie van de forward-angle light scatter versus een 90 light scatter histogram., Het percentage positief bevlekte cellen voor elk markerpaar, evenals het percentage dubbel bevlekte cellen werd bepaald. Schattingen van het absolute aantal positieve lymfocyten voor de respectieve oppervlaktemarkers werden bepaald door het aantal perifere lymfocyten te vermenigvuldigen met het percentage positief gekleurde cellen voor elk markerpaar. Ook werd het percentage dubbel bevlekte cellen bepaald., Schattingen van het absolute aantal positieve lymfocyten voor de respectieve oppervlaktemarkers werden bepaald door het aantal perifere lymfocyten te vermenigvuldigen met het percentage positieve cellen voor elke oppervlaktemarker.
meting van anti-myeline basic protein antilichamen:
humaan myeline basic protein (Hmbp) werd bereid met de methode van Diebler et al. (1972) en gecontroleerd op zuiverheid door polyacrylaminegelelektroforese. Antiserum tegen HMBP werd bij konijnen geïnduceerd door herhaalde injectie van HMBP in het volledige adjuvans van Freund., De antilichaamactiviteit in de konijnensera en de monsters van de patiënt werd gedetecteerd door verschillende verdunningen (1:100 tot 1:10.000) sera toe te voegen aan putjes van een microtiterplaat die eerder met HMBP was bedekt, als volgt: hmbp 250 g/ml werd opgelost in carbonaatbuffer, PH 9,6 en 200 l van deze oplossing werden aan elk putje toegevoegd. Na incubatie, wassen en blokkeren zoals hierboven beschreven, werden 200 1 van ofwel verdund konijn of menselijk serum toegevoegd aan de putjes. Na een incubatietijd van 1 uur bij 37 ° C werden de sera uit de putjes geschud en vervolgens 5 maal met wasoplossing gewassen., 200 1 peroxidase geconjugeerde geit anti-konijn of geit anti menselijke IgG, IgM of IgA (optimale verdunning) werden toegevoegd aan de juiste put. Na incubatie en herhaald wassen werden 200 1 ABTS-substraat aan elk putje toegevoegd. Platen werden gedurende een uur bij kamertemperatuur geïncubeerd en gelezen in een microtiter reader bij 405 tun golflengte. Met behulp van konijn antisera werd een titratiecurve uitgezet en werden de sera van de patiënt vergeleken met deze standaardcurve., Op basis van meer dan 200 controles en monsterbepalingen van patiënten werden liters groter dan 1:2000 voor IgA, 1:5000 voor IgM en 1:8000 voor IgG als positief beschouwd.