SDS-PAGE (natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese) wordt in het laboratorium vaak gebruikt voor de scheiding van eiwitten op basis van hun molecuulgewicht. Het is een van die technieken die vaak wordt gebruikt, maar niet vaak volledig begrepen. Dus laten we proberen dat op te lossen.
SDS-PAGE scheidt eiwitten volgens hun molecuulgewicht, op basis van hun differentiële migratiesnelheden door een zeefmatrix (een gel) onder invloed van een toegepast elektrisch veld.,
waarbij de snelheid van Eiwitmigratie evenredig is met het molecuulgewicht
de beweging van geladen soorten door een elektrisch veld wordt bepaald door de netto lading, de moleculaire straal en de grootte van het toegepaste veld. Maar het probleem met native gevouwen eiwitten is dat noch hun netto lading, noch hun moleculaire straal moleculair gewicht afhankelijk is. In plaats daarvan, wordt hun netto last bepaald door aminozuursamenstelling d.w.z. de som van de positieve en negatieve aminozuren in de proteã ne en moleculaire straal door de tertiaire structuur van de proteã ne.,
in hun oorspronkelijke staat zouden verschillende eiwitten met hetzelfde molecuulgewicht bij verschillende snelheden in een elektrisch veld migreren, afhankelijk van hun lading en 3D-vorm.
om eiwitten te scheiden in een elektrisch veld alleen op basis van hun molecuulgewicht, moeten we de tertiaire structuur vernietigen door het eiwit te reduceren tot een lineair molecuul, en op de een of andere manier de intrinsieke netto lading van het eiwit maskeren. Daar komt SDS bij kijken.,
de rol van SDS (et al)
SDS is een detergent dat aanwezig is in de monsterbuffer van de SDS-pagina waar het, samen met een beetje koken en een reductiemiddel (normaal DTT of B-ME om eiwit-eiwitdisulfidebindingen af te breken), de tertiaire structuur van eiwitten verstoort. Dit brengt de gevouwen proteã nen neer aan lineaire molecules.
SDS bedekt ook het eiwit met een uniforme negatieve lading, die de intrinsieke ladingen op de R-groepen maskeert. SDS bindt vrij uniform aan de lineaire proteã nen (rond 1.,4G SDS / 1g proteã ne), wat betekent dat de lading van de proteã ne nu ongeveer evenredig aan zijn molecuulgewicht is.
SDS is ook aanwezig in de gel om ervoor te zorgen dat zodra de eiwitten lineair zijn en hun ladingen gemaskeerd, ze zo blijven gedurende de hele run.
de dominante factor bij het bepalen van een met SDS gecoat eiwit is zijn moleculaire straal., SDS-gecoate eiwitten zijn lineaire moleculen, 18 Angstroms breed en met lengte evenredig aan hun molecuulgewicht, dus de moleculaire straal (en dus hun mobiliteit in de gel) wordt bepaald door het molecuulgewicht van het eiwit. Aangezien de SDS-met een laag bedekte proteã nen dezelfde Last aan massaverhouding hebben, zal er geen differentiële migratie zijn die op last wordt gebaseerd.
de Gelmatrix
in een toegepast elektrisch veld zullen de met SDS behandelde eiwitten zich nu met verschillende snelheden naar de positieve anode bewegen, afhankelijk van hun molecuulgewicht., Deze verschillende mobiliteit zal worden overdreven als gevolg van de hoge wrijving omgeving van een gel matrix.
zoals de naam al doet vermoeden, is de gelmatrix die voor SDS-PAGE wordt gebruikt polyacrylamide, wat een goede keuze is omdat het chemisch inert is en, cruciaal, gemakkelijk kan worden samengesteld in verschillende concentraties om verschillende poriegroottes te produceren, waardoor een verscheidenheid aan scheidingsomstandigheden kan worden gewijzigd afhankelijk van uw behoeften. U herinnert zich misschien dat ik eerder een artikel schreef over het mechanisme van acrylamide polymerisatie.,
het discontinue buffersysteem en het stapelen van Gel – langs de startlijn
om de stroom van de kathode (negatief) naar de anode (positief) door de gel te geleiden, is een buffer uiteraard nodig. Meestal gebruiken we het discontinue laemmli buffersysteem. “Discontinu” betekent gewoon dat de buffer in de gel en de tank verschillend zijn.
gewoonlijk wordt het systeem opgezet met een stapelgel bij pH 6,8, gebufferd door Tris-HCl, een hardloopgel gebufferd tot pH 8,8 door Tris-HCl en een elektrodebuffer bij pH 8,3., De stapelende gel heeft een lage concentratie acrylamide en de lopende gel een hogere concentratie geschikt om de beweging van de proteã nen te vertragen.
dus wat is er met al die verschillende pH ‘ s?
glycine kan bestaan in drie verschillende ladingstoestanden, positief, neutraal of negatief, afhankelijk van de pH. dit wordt weergegeven in het onderstaande diagram. Controle van de ladingstoestand van de glycine door de verschillende buffers is de sleutel tot het hele stapelen gel ding.,
zo werkt het stapelen van gel. Wanneer de macht wordt aangezet, worden de negatief-geladen glycineionen in de pH 8.3 elektrodebuffer gedwongen om het stapelende gel in te gaan, waar pH 6.8 is. In deze omgeving schakelt glycine voornamelijk over naar de zwitterionische (neutraal geladen) toestand. Dit verlies van lading zorgt ervoor dat ze heel langzaam bewegen in het elektrische veld.
De Cl-ionen (van Tris-HCl) daarentegen bewegen veel sneller in het elektrische veld en vormen een ionenfront dat Voor de glycine migreert., De scheiding van Cl-van het Tris-contra-ion (dat zich nu naar de anode beweegt) creëert een smalle zone met een steile spanningsgradiënt die de glycine achter zich trekt, resulterend in twee nauw gescheiden fronten van migrerende ionen; het zeer mobiele CL – front, gevolgd door het langzamere, meestal neutrale glycine-front.,
alle eiwitten in het gelmonster hebben een elektroforetische mobiliteit die tussen het uiterste van de mobiliteit van de glycine en Cl-ligt, dus wanneer de twee fronten goed door het monster vegen, worden de eiwitten geconcentreerd in de smalle zone tussen de CL – en glycinefronten.
en ze zijn uit!
deze processie gaat door tot het de hardloopgel raakt, waarbij de pH naar 8,8 gaat. Bij deze pH zijn de glycinemoleculen meestal negatief geladen en kunnen veel sneller dan de proteã nen migreren., Het glycinefront versnelt langs de eiwitten en laat ze achter in het stof.
het resultaat is dat de eiwitten in een zeer smalle band op het raakvlak van de stapeling en de hardloopgel worden gedumpt en omdat de hardloopgel een verhoogde acrylamideconcentratie heeft, waardoor de beweging van de eiwitten volgens hun grootte wordt vertraagd, begint de scheiding.
waar ging dat allemaal over?
Als u zich nog steeds afvraagt waarom de stapelgel nodig is, bedenk dan wat er zou gebeuren als u er geen zou gebruiken.,
Gelputten zijn ongeveer 1 cm diep en u moet ze over het algemeen aanzienlijk vullen om voldoende eiwit op de gel te krijgen. Dus bij afwezigheid van een stapelende gel zou uw monster bovenop de hardloopgel zitten, als een band van maximaal 1 cm diep.
in plaats van samen op een rij te staan en de hardloopgel samen te raken, zou dit betekenen dat de eiwitten in uw monster allemaal op verschillende tijdstippen in de hardloopgel zouden komen, wat resulteert in zeer uitgesmeerde banden.,
De stapelende gel zorgt ervoor dat alle eiwitten tegelijkertijd bij de lopende gel komen, zodat eiwitten met hetzelfde molecuulgewicht als strakke banden zullen migreren.
scheiding
zodra de eiwitten in de hardloopgel zitten, worden ze gescheiden omdat eiwitten met een hoger molecuulgewicht langzamer door de poreuze acrylamidegel bewegen dan eiwitten met een lager molecuulgewicht. De grootte van de poriën in de gel kan worden gewijzigd afhankelijk van de grootte van de eiwitten die u wilt scheiden door het veranderen van de acrylamide concentratie. Typische waarden worden hieronder weergegeven.,
voor een breder scheidingsbereik, of voor moeilijk te scheiden eiwitten, kan een gradiëntgel worden gebruikt met lagen met een toenemende acrylamideconcentratie.