Wat is Flow Cytometry (FACS analyse)?

oorspronkelijk ontwikkeld in de late jaren 1960, is flow cytometry een populaire analytische celbiologietechniek die gebruik maakt van licht om cellen te tellen en te profileren in een heterogeen vloeistofmengsel. Cytometry de stroom is een bijzonder krachtige methode omdat het een onderzoeker toestaat om snel, nauwkeurig, en eenvoudig gegevens met betrekking tot vele parameters van een heterogeen vloeibaar mengsel te verzamelen die levende cellen bevatten.,de Cytometrie van de

stroom wordt uitgebreid gebruikt door de levens-en Biomedische Wetenschappen, en kan in elk scenario worden toegepast waar een onderzoeker snel een grote populatie losse cellen in een vloeibare media moet profileren. Bijvoorbeeld, in immunologie wordt cytometry de stroom gebruikt om diverse immune celsubtypes wegens hun grootte en morfologie te identificeren, te scheiden, en te karakteriseren.

wanneer aanvullende informatie vereist is, worden antilichamen met fluorescerende kleurstoffen gelabeld en tegen zeer specifieke antigenen van het celoppervlak (bijv., clusters van differentiatie of CD-tellers) kunnen worden gebruikt om specifieke subpopulaties binnen een grotere groep beter te identificeren en te scheiden.

in een Stroomcytometer

• worden de Monstercellen één voor één door een smal kanaal geleid.
• licht wordt gebruikt om de cellen in het kanaal te verlichten.
• een reeks sensoren detecteert de soorten licht die door de cellen worden gebroken of uitgezonden.
• gegevens die door de sensoren worden verkregen, worden samengesteld en geïntegreerd om een volledig beeld van het monster te krijgen.,

FACS-Antilichamen momenteel gebruikt voor Onderzoek

de Verschillende Soorten van Licht in een Flow Cytometrie Experiment

Een flowcytometer maakt gebruik van gebroken of uitgestraald licht op te tellen en identificeren van cellen. Leer over verschillende die types van licht in een cytometry stroomexperiment in de volgende cijfers worden gebruikt.,

Forward Scatter

Forward scatter wordt gebroken door een cel in het stroomkanaal en gaat verder in het lichtpad (dat wil zeggen in dezelfde richting als het licht oorspronkelijk Reed). Het voorwaartse verspreide licht wordt ontdekt door een sensor in de lichte weg, en wordt typisch gebruikt om deeltjesgrootte te identificeren.

voorwaarts verstrooid licht wordt meestal gebruikt om de grootte van het object in het lichtpad te detecteren., Grotere objecten produceren meer verstrooid licht naar voren dan kleinere objecten, en grotere cellen hebben een sterker verstrooid signaal naar voren

Side Scatter

Side scatter licht gaat van de lichtbron naar het stroomkanaal, wordt gebroken door cellen in een richting die buiten het oorspronkelijke lichtpad ligt. Zijdelings verstrooid licht wordt gedetecteerd door een sensor die loodrecht staat op het oorspronkelijke lichtpad.,

zijwaarts verstrooid licht wordt meestal gebruikt om de granulariteit en complexiteit van de cel in het lichtpad te bepalen. Zeer korrelige cellen met een grote hoeveelheid interne complexiteit, zoals neutrofielen, zullen meer zij-verstrooid licht, en een hogere zij-verstrooiing signaal produceren dan cellen met een lage-granulariteit en complexiteit.

fluorescentie-emissie

fluorescentielicht wordt uitgezonden door fluorescerende moleculen na excitatie door een compatibele golflengtelaser., Het fluorescente licht kan van natuurlijk fluorescerende materialen in de cel afkomstig zijn, of kan van fluorescente kleurstoffen of fluorescentie-geëtiketteerde antilichamen afkomstig zijn die zijn gebruikt om een specifieke structuur op de cel te etiketteren.

Multiparametrische analyse

a mock flow cytometry dot-plot, ploting forward vs side-scattered from a population of leukocyten., Celpopulaties worden gekenmerkt door hun waarschijnlijke identiteit:

d vermoedelijk puin, zeer kleine items met lage lage voorwaartse – en zijverstrooiing.

L / M waarschijnlijke leukocyten / monocyten, kleine tot middelgrote cellen met lage interne complexiteit/granulariteit. Deze cellen genereren een medium forward-scatter en lage side-scatter signaalintensiteit

G waarschijnlijke granulocyten, grote cellen met een hoge interne complexiteit/granulariteit. Deze cellen genereren hoge forward-en side-scatter signalen.,

hoewel sommige identiteiten kunnen worden bevestigd door voorwaartse en zijverstrooiingsprofielen, biedt het labelen met een celtype-specifieke marker altijd een grotere resolutie en zekerheid bij het profileren van complexe heterogene populaties van cellen.

in de grafiek hierboven kan een onderzoeker bijvoorbeeld granulocyten en lymfocyten onderscheiden met voorwaarts en zijdelings verstrooid licht. Nochtans, zijn drie klassen van granulocytes (neutrophils, basophils, en eosinophils) zeer gelijkaardig in grootte en structuur, die hen gelijkaardige licht-het verspreiden eigenschappen geven., In dit geval, konden neutrofielen selectief worden geëtiketteerd op grond van hun uitdrukking een neutrofiel specifieke marker zoals ELANE.

FACS: Sorteercellen op basis van Flow Cytometry Data

De termen flow cytometry en fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) worden vaak door elkaar gebruikt. In de praktijk zijn er verschillen tussen de twee methoden.

FACS is een derivaat van flowcytometrie dat een uitzonderlijke mate van functionaliteit toevoegt. Met behulp van FACS kan een onderzoeker fysiek Sorteren een heterogeen mengsel van cellen in verschillende populaties.,

door gebruik te maken van zeer specifieke antilichamen gelabeld met fluorescente kleurstoffen, kan een onderzoeker FACS-analyse uitvoeren en tegelijkertijd gegevens verzamelen over, en een monster Sorteren op een bijna onbeperkt aantal verschillende parameters.

In een FACS-Experiment:

• worden Forward-scatter, side-scatter en fluorescente gegevens verzameld, zoals in conventionele flowcytometrie.
• door de gebruiker gedefinieerde parameters geven informatie over hoe cellen moeten worden gesorteerd.
• op basis van deze parameters gebruikt de FACS-machine een elektrode om een elektrische lading op te leggen aan elke cel.,
• bij het verlaten van de stroomkamer Sorteren elektromagneten cellen op lading in afzonderlijke vaten.

hoe zien Flowcytometriegegevens eruit?

in een flowcytometrie-experiment wordt elke cel die door de flowcytometer gaat en wordt gedetecteerd, geclassificeerd als een afzonderlijke gebeurtenis.

bovendien krijgt elk type licht dat wordt gedetecteerd door de flowcytometer (forward-scatter, side-scatter, en elke golflengte van fluorescentie-emissie) zijn eigen unieke kanaal toegewezen., Cytometry de gegevens van de stroom zullen elke gebeurtenis onafhankelijk plotten, en zullen de signaalintensiteit van licht vertegenwoordigen die in elk kanaal voor elke gebeurtenis wordt ontdekt.

Flow cytometriegegevens worden meestal weergegeven op een van de volgende twee manieren: histogrammen, die slechts één parameter meten of vergelijken, en dot-plots Die 2 of 3 parameters tegelijkertijd vergelijken op een twee – of driedimensionale scatter-plot.

een histogram toont gewoonlijk de intensiteit die in een enkel kanaal langs één as wordt gedetecteerd en het aantal gebeurtenissen dat bij die intensiteit wordt gedetecteerd, bevindt zich in een afzonderlijke as., Een groot aantal gebeurtenissen gedetecteerd op een bepaalde intensiteit zal worden weergegeven als een piek op het histogram.

daarentegen wordt in een puntplot elke gebeurtenis weergegeven als een enkel punt op een scatterplot. Intensiteit van 2 verschillende kanalen (of 3 verschillende kanalen in een driedimensionale plot) worden weergegeven langs de verschillende assen. Evenementen met een vergelijkbare intensiteit zullen zich in dezelfde regio op het verspreidingsgebied samenvoegen.

histogrammen en dot-plots bieden beide verschillende voordelen voor de analyse van flowcytometriegegevens. Kiezen hoe het beste om uw gegevens te vertegenwoordigen kan helpen ervoor te zorgen dat het vertelt een compleet verhaal in een eenvoudige, begrijpelijke indeling.

Dot-plots en histogrammen sluiten elkaar niet uit, en de meeste complexe flowcytometrie-experimenten zullen gebruik maken van meerdere plots om rijke, multi-parametrische gegevens op een monster weer te geven.

in veel gevallen moeten meer dan drie parameters gelijktijdig worden uitgezet., In dit geval, kan een gegevens-analysetechniek die als gating wordt bekend helpen om extra resolutie en flexibiliteit te geven, toestaand voor analyse van een bijna onbeperkte hoeveelheid parameters gelijktijdig over verscheidene verschillende spreidingsdiagrammen en histogrammen.

Gating voegt resolutie toe aan Stroomcytometriegegevens

kortom, gating is een methode voor het selecteren van cellen uit een stroomcytometrie-experiment dat u in meer specifiek detail wilt analyseren., Gating stelt een onderzoeker in staat om meer informatie over een subpopulatie van cellen te verzamelen en weer te geven dan normaal zou kunnen worden weergegeven op een 2 – of 3-dimensionale dot-plot.

Gating voegt resolutie toe aan een cytometrie-experiment van de stroom, en staat voor gelijktijdige analyse van een bijna onbeperkt aantal verschillende parameters (kanalen) toe.

In een gated Flow Cytometry Experiment:

• een gebruiker verzamelt flow cytometry gegevens van een of meer kanalen op een dot-plot.
• op basis van de verkregen gegevens tekent de gebruiker een poortvenster dat een subpopulatie van cellen selecteert voor verdere analyse.,
• de subpopulatie van cellen binnen de poort zal specifiek worden gemarkeerd op andere plots die informatie van alternatieve kanalen weergeven.

Gates voegen een ongelooflijke hoeveelheid flexibiliteit toe aan de cytometrie, waardoor een eencellige resolutie wordt toegestaan voor elk kanaal dat Voor de onderzoeker beschikbaar is. Meerdere poorten kunnen worden vastgesteld voor een enkele scatter-plot, en poorten kunnen worden “gestapeld” en gecombineerd (dat wil zeggen een subpopulatie van cellen gated voor in kanalen 1 en 2 kan verder worden gated voor kanalen 3 en 4 om meer specificiteit en diepere analyse mogelijk te maken).,

een voorbeeld van gating

een opmerking over compensatie

spill-over van het ene kanaal naar het andere kan valselijk als positief geïdentificeerde signalen veroorzaken. Spillover is het artefactual signaal dat één fluorescente kleurstof in het kanaal van een andere fluorophore als functie van zijn relatieve helderheid en emissiespectrum kan veroorzaken. Dit is waar compensatie in het spel komt. Compensatie is een procedure die het signaal van een bepaald kanaal isoleert van de andere kanalen die in hetzelfde experiment worden gebruikt. FITC bijv., heeft zijn emissiepiek in het groene bereik van het elektromagnetische spectrum. Het fluoresceert echter ook in het gele kanaal waar PE licht uitzendt. Simpel gezegd, compensatie trekt het FITC-signaal af van het PE-kanaal.

Dit signaal in het “verkeerde” kanaal wordt afgetrokken van het signaal veroorzaakt door fluorophore van belang. In de bovenstaande steekproef, is de verhouding van de groene en de gele component bij een bepaalde opwindingsgolflengte constant voor FITC., Het is dus mogelijk om de hoeveelheid niet-specifiek geel FITC-signaal in het PE-kanaal af te leiden uit de meting in het groene kanaal met behulp van de constante compensatiecoëfficiënten. Hetzelfde geldt voor de spill-over van de PE in het FITC-kanaal.