pulmonell utvärdering. Lungfunktionstester (PFT) gjordes med en Brentwood Spirometer på vårt kontor. Vissa patienter hade genomgått testning någon annanstans.
Immuntest. Tester utfördes på Immunosciences Laboratorier under ledning av A. Wojdani, Ph D.. Med tanke på betydelsen av dessa tester i samband med denna utvärdering beskrivs metoden i detalj.,
beredning av formaldehyd-humant serumalbumin (F-HSA) och formaldehyd-bovint serumalbumin (F-BSA) konjugat:
elektroforetisk och immunoelektroforetisk jämförelse av HSA, BSA med F-HSA och F-BSA utfördes för att bestämma konjugeringsförekomsten. Konjugering bevisades av förändrad rörlighet för F-HSA, F-BSA när den jämfördes med HSA respektive BSA. Dessutom bestämdes antalet fria amino-tillsättningsgrupper som finns i F-HSA eller F-BSA genom metoden för Snyder och Sobocinski (1975) och användes för att bedöma mängden substitution., Antalet aminogrupper bundna till formaldehyd var 26 för HSA och 31 för BSA. I denna beräkning övervägdes bildandet av intermolekylär tvärbindning.
beredning av toluendiisocyanat-humant serumalbumin (TDI-HSA) och bovint serumalbumin (TDI-BSA) konjugat:
denna beredning liknade metoderna för Dewar och Baur (1982). Enligt denna metod löstes 1g HSA eller 1g BSA i 100 ml av en buffertlösning innehållande kaliumklorid (0,05 mol/l), natriumborat (0,05 mol/l), PH 9,4 och kyldes till 4 C. dioxan (10 ml) innehållande 0.,15 ml toluendiisocyanat tillsattes sedan droppvis under omrörning under en period av 3 timmar, följt av tillsats av 2 ml etanolamin, centrifugering, dialysfiltrering och lyofilisering. I likhet med F-HSA och F-BSA bekräftades konjugering genom elektrofores och bestämning av fria aminogrupper närvarande i konjugatet. Antalet aminogrupper bundna till TDI var 37 för HSA och 43 för BSA. Dessutom gjordes spektrografisk analys av konjugatet enligt Zeiss et. al. (1980)., Det fanns en markant ökning av absorptionen från 230 till 260 nm vilket indikerade att TDI hade blivit kovalent kopplat till proteinbäraren. Denna ökning av absorptionen överensstämde med NH2 gruppbestämning endast 76% för HSA och 81% för BSA
beredning av trimellitisk anhydrid-humant serumalbumin (TMA-HSA) och Trimellitisk anhydrid bovint serumalbumin (TMA-BSA):
för att förbereda dessa konjugat 25 mg. tma upplöstes i 0,5 ml dioxan och sattes droppvis antingen till 25 mg HSA eller BSA upplöst i 5 ml kallt 7% NaHCO3 i vatten., Efter omrörning i 60 minuter vid 4 C dialyserades konjugaterna mot fyra förändringar av 0,1 M NaHCO3 och en förändring av bufferten. Slutligen filtrerades konjugaterna och hölls vid -20 C tills de användes. OD-analyser av TMA-HSA och TMA-BSA gjordes för att bestämma antalet TMA-rester kopplade till motsvarande bärarprotein. Koncentrationen av bärarproteinet omvandlades till molär koncentration med molekylvikten av HSA och BSA. Från förhållandet mellan molarkoncentrationen av TMA-ligand och proteinbäraren beräknades förhållandet mellan TMA-rester per bärarmolekyler., TMA-HSA uppskattades innehålla 5 TMA-rester per HSA-molekyler och för TMA-BSA sju rester per albuminmolekyl (Pien et al., 1988).
beredning av ftalsyraanhydrid-humant serumalbumin (PA-HSA) och Ftalsyraanhydrid bovint serumalbumin (PA-BSA) konjugat:
dessa haptenkonjugat framställdes genom tillsats av 75 mg PA till en kyld lösning av 300 mg HSA eller BSA i 100 ml H2O. reaktionsblandningen omrördes över natten, dialyserades mot 0,1 M PBS med användning av rör med en cutoff av 8000 dalton. Med hjälp av metoden för Zeiss et. al. (1977) de molära förhållandena beräknades., De molära förhållandena befanns vara 22/28 för PA/HSA och 25/30 för PA / BSA.
beredning av bensenring HSA (B-HSA) och bensenring BSA (B-BSA) konjugat:
för dessa preparat, 40 mg. av p-aminobensoesyra löstes i 2 ml 1 N HCL och kyldes genom nedsänkning i ett isbad. En kall lösning på 14 mg / ml tillsattes droppvis. Efter varje tillsats omrördes blandningen i 30 sekunder. Parallellt löstes ett gram HSA eller BSA i borsyra 0,16 m natriumklorid (0-15 m) Buffert PH 9,0 (PH höjdes med NaOH)., Bägarna som innehöll albumins lösningar var omgivna av ett isbad på magnetisk omrörare. Lösningen av diazoniumsalt tillsattes droppvis, med snabb omrörning till den kalla proteinlösningen. Efter tillsats av varje droppe justeras PH till 9.0 till 9.5 med en normal NaOH. När all lösning hade tillsatts fick reaktionen fortsätta med långsam omrörning i minst en timme med ytterligare tillsatser av NaOH-lösning och bibehållande av PH i intervallet 9, 0 till 9, 5., Oreagerade små molekyler avlägsnades genom omfattande dialys eller genom passage genom en kolonn sephadex G-25 i kylrummet, med en isotonisk saltlösning som elueringsbuffert. OD-analyser av orange färgutveckling av B-HSA och B-BSA gjordes för att bestämma antalet B-rester kopplade till motsvarande bärprotein. Beloppet av B ersättning för HSA var cirka 41 och för BSA 53 (Migrdichian, 1957).
Antikroppsbestämning:
specifika antikroppar mot f-HSA, TDI-HSA, tma-HSA, PA-HSA och B-HSA analyserades genom en icke-competitive ELISA-analys., Brunnar av mikrotiterplattor (Dynatech, Alexandria, VA) var belagda med 100 1 antigenlösningar (100 g/ml) i 0.1 m PBS PH 7.2 över natten vid 4 C. plattorna tvättades 4 gånger med 0.1 m PBS innehållande 0.05% tween 20 mellan varje steg. Fria absorptionsställen blockerades med 2% proteinfritt bovint serumalbumin i rumstemperatur i 4 timmar och lagrades vid -20 C tills det användes.,
analytisk procedur:
proceduren inkluderade följande: (1) Tvätta fyra gånger, (2) tillsats av 100 1 av utspätt serum (1:2 för IgE och 1:100 för IgM och IgG) i PBS tween-20 med 1% BSA (3) inkubation i 4 timmar vid 20 C, följt av tvättning 4 gånger, (4) tillsats av 100 1 av en optimal utspädning av alkaliskt fosfatas märkt affinitetsrenad get anti-human IgE ( ) (1:200), IgM (1:500) och anti IGG (1:1000), köpt från KPI (Maryland) (5) inkubation under 120 minuter vid 20 C, (6) tvättning 6 gånger, (7) tillsats av 100 1 av p-nitrofenylfosfat (Sigma Chemical Co.,) (8) inkubation under 60 minuter vid 20 C (9) tillsats av 50 1 av 3 N natriumhydroxidlösning, och (10) dubbel avläsning. Resultaten beräknades utifrån absorbanser av dubblettprover på 405 nm med hjälp av mikrotiterläsare. Alla prover lästes mot ett HSA-antigen som en kontroll av bindning som inte är specifik för F-HSA, TDI-HSA, tma-HSA, PA-HSA och B-HSA. Resultaten uttrycktes som titer. Titer är den sista utspädningen av serum som ger absorbansen två gånger HSA-kontrollen.,
specificitet och Korshämningsstudier:
för bestämning av antikroppsspecificitet genomfördes en korshämningsstudie. Positivt serum för varje hapten-proteinkonjugat kördes efter lämplig inkubation och Utfällning med tiofaldigt ökande ökningar av haptenbundet HSA eller BSA som hämmare för att täcka antikroppsintervallet till antigenöverskott. Detta område var mellan 50 g till 1000 g för hapten-BSA och 80 g till 1000 g för hapten-RSA., Efter inkubation vid 37 C och avlägsnande av fällningen genom centrifugering placerades proverna från före och efter korshämningsstudien på plattor med brunnar belagda med det specifika konjugatet. De efterföljande stegen följdes enligt beskrivningen ovan för ELISA-studien.
IgG-och IgM-antikroppsbindning till olika konjugat hämmades av hapten – HSA eller hapten-BSA från 36-85%. Vid en given koncentration hämmade både hapten-HSA och hapten-BSA antikroppsnivån på liknande sätt.,
partiell hämning av IgE-antikroppsbindning till olika haptenkonjugat observerades när serum inkuberades i förväg med hapten-HSA eller hapten-BSA. Denna ofullständiga observation av hämning av IgE-antikropp var huvudsakligen relaterad till avsaknad av serum med höga IgE-titrar mot olika kemikalier i vårt laboratorium.,
bestämning av normala nivåer av antikroppar (kontroller):
baserat på ovanstående förfaranden undersöktes 160 bloddonatorprover av friska individer, av båda könen, mellan 22-55 år, för antikroppsnivåer mot f-HSA, TD-HSA, TMA-HSA, PA-HSA och B-HSA. Den genomsnittliga titer 1:800 400 för IgG, 1:3200 1600 för IgM och 1:8 4 för IgE. Således anses i våra laboratorietitrar större än 1:1600 för IgG, 1:6400 för IgM och 1:16 för IgE vara positiva.,
hos en given patient ansågs ökningar eller fall i antikroppstitrar med mer än en utspädning vara signifikanta (Se tabeller).
Lymfocyt Subset uppräkning:
en enda laserflödescytometer (Epics Profile: Coulter Epics, Inc., Hialeah, FL) som diskriminerar framåt och rät vinkel ljus scatter, liksom två färger, användes med ett programpaket (Quad Stat: Coulter). Mononukleära cellpopulationer bestämdes av tvåfärgad direkt immunofluorescens genom att använda en helblodfärgningsteknik med lämplig monoklonal antikropp och flödescytometri (Fletcher et al.,, 1989) följande par av fluorescein isothiocyanate (FITC), eller fykoerytrin (PE)-konjugerade monoklonala antikroppar (Coulter immunologi) valdes: T11-RDI/B4-FITC, T4-RDI/T8-FITC, T3-FITC/NKH-1-forskning, utveckling och innovation och T11-FITC/Tal-PE för bestämning av T-cell – /B-celler, T-helper/T-suppressor, NKHT3+ /NKHY3 och för alternativ väg av lymfocyt aktivering resp.
för att övervaka lymfocytmarkörer sattes bat-kartor på lymfocytpopulationen av den framåtriktade ljusspridningen mot ett 90-ljusspridningshistogram., Andelen positivt färgade celler för varje markörpar, liksom andelen dubbelt färgade celler bestämdes. Uppskattningar av det absoluta antalet lymfocyter som är positiva för respektive ytmarkörer bestämdes genom att multiplicera antalet perifera lymfocytceller med procentandelen positivt färgade celler för varje markörpar. Dessutom bestämdes andelen dubbelt färgade celler., Uppskattningar av det absoluta antalet lymfocyter som är positiva för respektive ytmarkörer bestämdes genom att antalet perifera lymfocytceller multiplicerades med procentandelen positiva celler för varje ytmarkör.
mätning av anti-myelin-basproteinantikroppar:
humant myelin-basprotein (HMBP) framställdes med Diebler et al. (1972) och kontrolleras för renhet genom polyakrylamingelelektrofores. Antiserum mot HMBP inducerades hos kaniner genom upprepad injektion av Hmbp i komplett Freunds adjuvans., Antikroppsaktivitet i kaninsera och patientens prover detekterades genom tillsats av olika utspädningar (1:100 till 1:10,000) av serum till brunnar av en mikrotiterplatta som tidigare belagts med HMBP enligt följande: hmbp 250 g/ml löstes i karbonatbuffert, PH 9.6 och 200 l av denna lösning tillsattes till varje brunn. Efter inkubation, tvättning och blockering enligt ovan tillsattes 200 1 av antingen utspädd kanin eller humant serum till brunnarna. Efter inkubation i timme vid 37 C skakades sera ut ur brunnarna och tvättades sedan 5 gånger med tvättlösning., 200 1 av peroxidas-konjugerad get anti-kanin eller get anti human IgG, IgM eller IgA (optimal utspädning) tillsattes till lämplig brunn. Efter inkubation och upprepad tvättning sattes 200 1 ABTS-substrat till varje brunn. Plattorna inkuberades i en timme vid rumstemperatur och lästes i en mikrotiterläsare vid 405 tun våglängd. Användning av kaninantisera; en titreringskurva ritades och patientens sera jämfördes med denna standardkurva., Baserat på mer än 200 kontroller och patienternas provbestämningar ansågs liter större än 1:2000 för IgA, 1:5000 för IgM och 1:8000 för IgG vara positiva.