DNA-Gel elektrofores är en teknik som används för att separera och identifiera DNA-fragment baserat på storlek.
DNA – fragment av olika storlekar laddas i en porös gel tillverkad av agaros-ett kolhydrat som finns i röda alger.
När ett elektriskt fält appliceras kommer fragmenten att migrera genom gelén tack vare de negativt laddade fosfatgrupperna i DNA-nukleotider.
mindre bitar av DNA kommer lättare att migrera genom gelén än större fragment, som har en svårare tid att röra sig genom gelmatrisen.,
När gelkörningen är klar kan platsen för dina DNA-prover jämföras med en serie fragment eller band av kända storlekar, som kallas en DNA-stege.
närvaron av ditt fragment av intresse kan sedan bekräftas baserat på dess storlek, vilket bestäms genom att jämföra den relativa platsen för ditt testprov till fragmenten av stegen.
agarosgeler bereds med en vikt över volymprocentlösning. Så 1 gram agaros i 100 ml buffert kommer att göra en 1% gel., Lägre procent geler kommer bättre att lösa större fragment och högre procent geler kommer att göra mindre fragment lättare att identifiera. För att starta geltillverkningsproceduren, väga in lämplig massa agaros i en Erlenmeyerkolv.
Lägg till körbuffert i kolven, så att buffertvolymen inte är större än 1/3 av kolvens kapacitet. Snurra sedan för att blanda.
smälta agaros / buffertblandningen genom uppvärmning i mikrovågsugn med maximal effekt. Var trettio sekunder, ta bort kolven och snurra innehållet för att blanda väl. Upprepa tills agarosen är helt upplöst.,
tillsätt sedan etidiumbromid till en koncentration av 0, 5 mg / ml. Ethidium bromid är en aromatisk förening som passar in mellan enskilda baspar av DNA, eller intercalates, och orsakar DNA att avge intensiv orange fluorescens under UV-ljus. Det är viktigt att notera att ethidiumbromid är cancerframkallande, så handskar ska alltid användas vid hantering av geler som innehåller denna förening.
för att förhindra att gelbrickan vrids, låt agarosen svalna genom att placera den i ett 65ºC vattenbad.
eftersom agarosen kyler, förbered gelformen genom att placera gelbrickan i gjutapparaten., Som ett alternativ kan du använda tejp för att täta de öppna kanterna på gelbrickan för att skapa formen. Att placera en kam i gelén skapar brunnarna där DNA laddas. Se till att kammen kommer att skapa en brunn som är lämplig storlek för ditt DNA-prov.
häll den smälta agarosen i gelformen och låt den härda vid rumstemperatur.
Efter att agarosen har härdat, ta ut kammen. Om gelén inte ska användas omedelbart, linda den i plastfolie och förvara vid 4ºC tills användning.
om gelén ska användas omedelbart, placera den i gelboxen.,
för att påbörja denna procedur, tillsätt färgämnet vid gelbelastning till de DNA-prover som ska separeras. Lastning färgämne görs vanligen vid en 6x koncentration. Laddningsfärg hjälper till att visualisera och ladda prover i brunnarna och hjälper till att bestämma hur långt proverna har migrerat under körningen.
Ställ in strömförsörjningen till önskad spänning.
lägg nu till tillräckligt med löpbuffert i gelboxen för att täcka gelens yta. Se till att använda samma körbuffert som den som används för att förbereda gelén.
Anslut ledningarna på gelboxen till strömförsörjningen och sätt på den., Kom ihåg att DNA är negativt laddat och kommer att röra sig mot anoden, vilket är positivt och i allmänhet rött i färg. Se till att inte ansluta den svarta ledningen eller katoden till botten av gelboxen. Så du glömmer inte, kom ihåg att svarta katter är otur eller negativ, och den svarta katoden är därför negativ. Kör din gel till rött, eller anoden. För att verifiera att både gelboxen och strömförsörjningen fungerar; utseendet av bubblor vid elektroderna indikerar att strömmen passerar genom.
Ta bort locket på gelboxen., Ladda långsamt och försiktigt DNA-proverna i gelén. Återigen tillåter laddningsfärgen i provet att provet sjunker in i gelén och hjälper till att spåra hur långt provet har rest. En DNA-storlek markör, eller stege, bör alltid laddas tillsammans med experimentella prover.
Sätt tillbaka locket. Dubbelkontrollera att elektroderna är anslutna till rätt spår i strömförsörjningen.
slå på strömmen. Kör gelén tills färgämnet har migrerat till ett lämpligt avstånd.
När elektroforeskörningen är klar, stäng av strömförsörjningen och ta bort locket på gelboxen.,
Ta bort gelén från gelboxen och dränera bort överflödig buffert på gelens yta. Placera gelfacket på pappershanddukar för att absorbera eventuell kvarvarande buffert.
för att visualisera DNA-fragmenten, ta bort gelén från gelbrickan och exponera gelén för ultraviolett ljus.
DNA-fragment ska visas som orange fluorescerande band. Ta en bild av gelén.
i slutet av försöket, kassera gelén och körbufferten på rätt sätt enligt institutionens föreskrifter. Återigen, kom ihåg att alltid hantera gelén och köra buffertar med handskar för att undvika ethidium bromid exponering.,
nu när du har sett hur man utför DNA-gelelektrofores. Låt oss ta en titt på några nedströms applikationer och variationer av denna mycket användbara metod.
här ser du ett agarosegelelektroforesresultat efter att ha separerat PCR-produkter. DNA-fragmenten som laddas in i gelén är synliga som tydligt definierade band. DNA-standarden eller stegen ska separeras i en grad som möjliggör användbar bestämning av storleken på provband. I detta exempel separeras DNA-fragment av 765 baspar, 880 baspar och 1022 baspar på en 1.,5% agarosgel med en 2-log DNA-stege.
förutom att bekräfta närvaron av ett DNA-fragment av intresse kan DNA-gelelektrofores kombineras med gelreningsprocedurer. Vanligtvis används ett rakblad för att skära ut DNA-fragmentet av intresse, så att det kan samlas in och DNA-provet inom det återvinns.,
Agaros gel electrophesis kan också kombineras med överföring blotting, vilket innebär att DNA eller RNA kan överföras till ett cellulosamembran där radioaktiva prober kan användas för att identifiera specifika DNA-eller RNA-sekvenser i ditt elektroforetiskt separerade prov.
standard DNA gel elektrofores är inte idealisk för separation av hög molekylvikt DNA större än 15-20 kb i storlek, som genomiskt DNA. För att separera stora DNA-prover används pulsfältsgelelektrofores, vilket innebär att gelén utsätts för ett föränderligt eller pulserande elektriskt fält i olika riktningar., Denna teknik innefattar en specialiserad gelkörningsapparat, som har Par elektroder arrayed i olika orienteringar runt gelén. Detta kan användas för att upptäcka skillnader i genomstorlekar mellan populationer av organismer, som de poolade DNA-proverna från olika mikrobiella samhällen, ser du här som tas från olika sjömiljöer.
Du har just sett en introduktion till DNA-gelelektrofores., Vi visade dig konceptet bakom metoden, hur man förbereder agarosgelen, hur man laddar dina prover, hur man kör gelén och analyserar den och några vanliga tillämpningar av agarosgelelektrofores. Tack för att du tittade och lycka till med att köra din gel.