SDS-PAGE (natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores) används ofta i labbet för separation av proteiner baserat på deras molekylvikt. Det är en av de tekniker som ofta används men inte ofta helt klarlagda. Så låt oss försöka fixa det.
SDS-PAGE separerar proteiner enligt deras molekylvikt, baserat på deras differentialhastigheter för migration genom en siktmatris (en gel) under påverkan av ett applicerat elektriskt fält.,
att göra graden av Proteinmigration proportionell mot Molekylvikt
förflyttningen av en laddad art genom ett elektriskt fält bestäms av dess nettoladdning, dess molekylradie och storleken på det applicerade fältet. Men problemet med inbyggt vikta proteiner är att varken deras nettoladdning eller deras molekylradie är molekylviktberoende. I stället bestäms deras nettoladdning av aminosyrasammansättningen d. v.s. summan av de positiva och negativa aminosyrorna i proteinet och molekylradien genom proteinets tertiära struktur.,
så i sitt hemland, olika proteiner med samma molekylvikt skulle migrera vid olika hastigheter i ett elektriskt fält beroende på deras laddning och 3D-form.
för att separera proteiner i ett elektriskt fält baserat endast på deras molekylvikt måste vi förstöra den tertiära strukturen genom att minska proteinet till en linjär molekyl och på något sätt maskera proteinets inneboende nettoladdning. Det är där SDS kommer in.,
rollen av SDS (et al)
SDS är ett tvättmedel som finns i SDS-sidan provbuffert där, tillsammans med lite kokande, och ett reduktionsmedel (normalt DTT eller B-ME att bryta ner protein-protein disulfidbindningar), stör den tertiära strukturen av proteiner. Detta leder de vikta proteinerna ner till linjära molekyler.
SDS täcker också proteinet med en enhetlig negativ laddning, vilket maskerar de inneboende avgifterna på R-grupperna. SDS binder ganska jämnt till de linjära proteinerna (runt 1.,4g SDS / 1g protein), vilket innebär att laddningen av proteinet nu är ungefär proportionell mot dess molekylvikt.
SDS är också närvarande i gelén för att se till att när proteinerna är linjäriserade och deras avgifter maskerade, de stannar så under hela körningen.
den dominerande faktorn vid bestämning av ett SDS-belagt protein är dess molekylradie., SDS-belagda proteiner har visat sig vara linjära molekyler, 18 Angstromer breda och med längd proportionell mot deras molekylvikt, så molekylradien (och därmed deras rörlighet i gelén) bestäms av proteinets molekylvikt. Eftersom SDS-belagda proteiner har samma laddning till massförhållande, kommer det inte att finnas någon differentiell migration baserad på laddning.
gelmatrisen
i ett tillämpat elektriskt fält kommer de SDS-behandlade proteinerna nu att röra sig mot den positiva anoden i olika takt beroende på deras molekylvikt., Dessa olika mobiliteter kommer att överdrivas på grund av en gelmatris höga friktionsmiljö.
som namnet antyder är gelmatrisen som används för SDS-PAGE polyakrylamid, vilket är ett bra val eftersom det är kemiskt inert och, avgörande, lätt kan bestå i olika koncentrationer för att producera olika porstorlekar som ger en mängd olika separeringsförhållanden som kan ändras beroende på dina behov. Du kanske kommer ihåg att jag tidigare skrev en artikel om mekanismen för akrylamidpolymerisering.,
det diskontinuerliga Buffertsystemet och Staplingsgelén-radar upp dem vid startlinjen
för att leda strömmen från katoden (negativ) till anoden (positiv) genom gelén behövs uppenbarligen en buffert. För det mesta använder vi det diskontinuerliga laemmli buffertsystemet. ”Diskontinuerlig” betyder helt enkelt att bufferten i gelén och tanken är olika.
vanligtvis är systemet upprättat med en staplingsgel vid pH 6.8, buffrad av Tris-HCl, en löpande gel buffrad till pH 8.8 av Tris-HCl och en elektrodbuffert vid pH 8.3., Staplingsgelén har en låg koncentration av akrylamid och running gel en högre koncentration som kan fördröja rörelsen av proteinerna.
så vad är det med alla dessa olika pH-värden?
Tja, glycin kan existera i tre olika laddningstillstånd, positiva, neutrala eller negativa, beroende på pH. detta visas i diagrammet nedan. Kontroll av glycinets laddningstillstånd av de olika buffertarna är nyckeln till hela staplingsgel saken.,
Så här fungerar staplingsgelén. När strömmen slås på tvingas de negativt laddade glycinjonerna i pH 8.3 elektrodbufferten att komma in i staplingsgelén, där pH är 6.8. I denna miljö växlar glycin övervägande till zwitterionisk (neutralt laddad) tillstånd. Denna förlust av laddning gör att de rör sig mycket långsamt i det elektriska fältet.
Cl-jonerna (från Tris-HCl) å andra sidan rör sig mycket snabbare i det elektriska fältet och de bildar en jonfront som migrerar före glycinet., Separationen av Cl-från Tris-motjonen (som nu rör sig mot anoden) skapar en smal zon med en brant spänningsgradient som drar glycinet längs bakom det, vilket resulterar i två snävt separerade Fronter av migrerande joner; den mycket mobila Cl – fronten, följt av den långsammare, mestadels neutrala glycinfronten.,
alla proteiner i gelprovet har en elektroforetisk rörlighet som är mellanliggande mellan den extrema rörligheten hos glycin och Cl-, så när de två fronterna sveper genom provet väl koncentreras proteinerna i den smala zonen mellan Cl – och glycinfronterna.
och de är av!
denna procession fortsätter tills den träffar den löpande gelen, där pH växlar till 8.8. Vid detta pH är glycinmolekylerna mestadels negativt laddade och kan migrera mycket snabbare än proteinerna., Så glycinfronten accelererar förbi proteinerna och lämnar dem i dammet.
resultatet är att proteinerna dumpas i ett mycket smalt band vid gränssnittet för staplings-och löpgeler och eftersom den löpande gelén har en ökad akrylamidkoncentration, vilket saktar proteinets rörelse enligt deras storlek, börjar separationen.
vad handlade det om?
om du fortfarande undrar varför staplingsgelén behövs, tänk på vad som skulle hända om du inte använde en.,
Gelbrunnar är cirka 1 cm djupa och du behöver i allmänhet väsentligt fylla dem för att få tillräckligt med protein på gelén. Så i avsaknad av en staplingsgel skulle ditt prov sitta ovanpå den löpande gelén, som ett band på upp till 1 cm djupt.
i stället för att vara uppradade tillsammans och slå running gel tillsammans, skulle detta innebära att proteinerna i ditt prov skulle alla komma in i running gel vid olika tidpunkter, vilket resulterar i mycket smort band.,
så staplingsgelén säkerställer att alla proteiner kommer fram till den löpande gelén samtidigt så att proteiner av samma molekylvikt kommer att migrera som snäva band.
Separation
när proteinerna är i den löpande gelen separeras de eftersom proteiner med högre molekylvikt rör sig långsammare genom den porösa akrylamidgelén än proteiner med lägre molekylvikt. Storleken på porerna i gelén kan ändras beroende på storleken på de proteiner du vill separera genom att ändra akrylamidkoncentrationen. Typiska värden visas nedan.,
för ett bredare separationsområde, eller för proteiner som är svåra att separera, kan en gradientgel, som har lager av ökande akrylamidkoncentration, användas.