CRISPR/Cas9-kärnorna har använts i stor utsträckning för genomredigering i olika organismer. Cas9-nukleaser komplexa med en guide RNA (Cas9-gRNA) hitta sina mål genom att skanna och förhöra genomiskt DNA för sekvenser som kompletterar gRNA., Erkännande av DNA-målsekvensen kräver en kort protospacer intilliggande motiv (PAM) som ligger utanför denna sekvens. Med tanke på att effektiviteten hos målplatsen kan bero på styrkan i interaktioner som främjar måligenkänning, försökte vi här jämföra affiniteter av olika Cas9-kärnor för deras kognitiva PAM-sekvenser., I detta syfte har vi mätt tillhörighet av Cas9 nucleases från Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, och Francisella novicida komplex med guide Rna (gRNAs) (SpCas9-gRNA, SaCas9-gRNA, och FnCas9-gRNA, respektive) och av tre modifierade SpCas9-gRNA varianter med förändrad PAM särdrag för kort, PAM-innehållande DNA-prober. Vi använde en” beacon ”- analys som mäter de relativa affiniteterna hos DNA-prober genom att bestämma deras förmåga att konkurrenskraftigt påverka graden av Cas9-gRNA-bindning till fluorescentmärkta mål-DNA-derivat som kallas ” Cas9-fyrar.,”Vi observerade signifikanta skillnader i affiniteterna för cognate PAM-sekvenser bland de studerade Cas9-enzymerna. De relativa affiniteterna hos SpCas9-gRNA och dess konstruerade varianter för kanoniska och suboptimal PAMs korrelerade med tidigare resultat om effektiviteten hos dessa PAM-sekvenser i genomredigering. Dessa fynd tyder på att hög affinitet av ett Cas9-nukleas för dess cognate PAM främjar högre genomredigeringseffektivitet.