Specificiteten och Effektiviteten av Uracil DNA Glycosylase-Medierad Strand Klyvning Tillfrågade på Stora Sekvens Bibliotek

UDG-medierad uracil excision och kemiska AP webbplats klyvning på microarrays

DNA-strängen klyvning förmedlas av UDG består av två separata steg: excision av uracil bas följt av klyvning av den resulterande abasic webbplats. De två stegen kan övervakas separat på DNA-mikroarrays., För det första genereras abasiska platser genom att behandla matrisen med UDG och i ett andra steg induceras strängklyvning genom att exponera de ytbehandlade, DNA-oligonukleotider som innehåller abasiska ställen till antingen sura eller grundläggande förhållanden eller genom att förånga ytan till torrhet. Sådana kemiska strategier för att klyva abasiska platser på DNA-strängar eliminerar behovet av ytterligare enzymatisk klyvning och tillåter att UDG-kinetiken studeras oberoende., För detta ändamål har matriser av 30mer DNA-sekvenser med ett ökande antal icke-på varandra följande dU – inkorporationer (dU1-du9) konstruerats och syntetiserats av maskless nukleinsyrafotolitografi, med användning av motsvarande ljuskänslig du phosphoramidite (Fig. 2). Varje DNA-sträng syntetiserades med en dt15-linker till glasytan och avslutades vid 5′-änden med en 25mer målsekvens för hybridisering (QC25), som anges i Fig. 3.,

placeringen av alla sondsekvenser tillsammans med motsvarande replikat och kontrollsträngar som bär dT istället för du-nukleotider randomiserades över mikroarrayytan., Före enzymatisk bearbetning hybridiserades DNA-sondsekvenserna till den Cy3-märkta komplementära 25mer-oligonukleotiden (QC25c) för att bestämma initiala fluorescensintensitetsvärden. 3 ’ – cy3-märkning användes för att förhindra eventuella fluorescensartefakter på grund av färgämnets interaktioner med det variabla antalet dUs46. Mikroarrayerna exponerades sedan för kommersiellt framställd UDG från E. coli och klyvningen av den abasiska platsen utfördes därefter under olika förhållanden. Den optimala enzymexponeringstiden bestämdes i initiala experiment. Våra resultat (Fig., S1) visar att efter tillsats av enzymet ökar klyvningseffektiviteten signifikant med tiden, upp till en timme och når en effektivitet på ungefär 50-60%, med endast små förändringar vid ytterligare exponering för UDG. Vi ställer sålunda den optimala exponeringstiden till en timme. Dessutom visar våra data tydligt ökad klyvningseffektivitet med ett ökande antal dU, från 40 till 60% (fikon. 3C och S1).

Vi gick sedan vidare för att studera det faktiska klyvningssteget, avlägsnandet av den abasiska platsen efter excision av uracil-basen., Efter kända strategier för kemiskt inducerad abasisk klyvning i lösning20, 30, spjälkades de resulterande AP-platserna sedan antingen under alkaliska förhållanden genom att doppa matriserna i en 1: 1(v/v) lösning av etylendiamin (Eda)/etanol, eller matriserna behandlades under sura förhållanden genom att doppa i en 30% (v/v) lösning av triklorättiksyra i diklorometan, eller genom att förånga ytan av matrisen till torrhet. I alla metoder utfördes behandlingarna under olika tidsperioder, från 1 till 24 timmar., Därefter rehybriderades arrayerna till den Cy3-märkta komplementära 25mer-oligonukleotiden (QC25c) och de resulterande fluorescensintensiteterna jämfördes med de som erhölls före UDG-behandling för att bestämma klyvningseffektivitet. De resulterande klyvningshastigheterna anges i Fig. 4.

under grundläggande förhållanden (Fig. 4B), klyvning av AP-platser kräver en minsta inkubationsperiod på 2 timmar för att observera signifikant klyvning (40 till 60%) av substraten. Behandling av matrisen med en syra eller torkning av ytan (Fig., 4A, C, respektive) resulterar i tydlig och omfattande klyvning efter endast en timme (30 till nästan 80% med en sur behandling), när Eda-medierad abasisk plats klyvning är minimal efter en timme. Det är troligt att klyvningsreaktionen i sig i A-och C-metoderna främjas vid det slutliga hybridiseringsstadiet, antingen på grund av temperatur eller närvaron av en amin i bufferten., Eftersom hybridiseringen är gemensam för alla tre metoderna antyder de stora skillnaderna i klyvkinetik mellan grundläggande och icke-grundläggande behandlingar möjligheten att ytterligare AP-platser kan produceras i närvaro av en syra eller under reducerat tryck, vilket ger ytterligare positioner på DNA-strängarna vid vilka en följande klyvningsreaktion kan uppstå. Längre behandlingar, oavsett metod, ändrar inte signifikant klyvningsgraden, vanligtvis närmar sig 40% till 80% beroende på antalet dU-inkorporationer., Vi ser faktiskt en tydlig total ökning av klyvningseffektiviteten med ett ökande antal dubbelinkorporationer, under alla testade förhållanden.

förutom att utföra kemiskt inducerad DNA-strängspaltning på abasiska platser undersöktes kvaliteten på mikroarrayytan. För detta ändamål undersöktes likformigheten hos funktionerna på matrisytorna visuellt baserat på fluorescensintensiteter och förlust av fluorescens för de icke-klyvbara kontrollsträngarna övervakades., Vi fann att abasic plats klyvning under alkaliska förhållanden tillåts för specifika, enzymmedierad klyvning av dU-innehållande sekvenser men lämnade kontrollsekvenser praktiskt taget orörd, medan under sura förhållanden, DNA strand klyvning observerades också för kontrollsträngar saknar uracil nukleotider (Fig. S2). Torkning av ytan ledde också till nedbrytning av DT-only-kontrollsträngarna. Eftersom endast abasisk plats klyvning under alkaliska förhållanden undviker ytdegradering och icke-specifik förlust av DNA, utförde vi alla efterföljande experiment under dessa förhållanden., Detta säkerställer att de icke-klyvbara kontrollsekvenserna förblir tillgängliga för jämförelse även efter lång kemisk behandling.

enkel – och dubbelsträngad UDG sekvens beroende

eftersom våra resultat på E. coli UDG-medierad du klyvning levererade endast måttlig klyvning effektivitet för DNA-strängar som innehåller enstaka dU inkorporationer (40%), Vi förhör sekvensen specificitet UDG för att potentiellt identifiera en mycket klyvad dU – innehållande substrat. För detta ändamål utformade vi ett du-innehållande nukleinsyror bibliotek från dubbel-och enkelsträngade DNA-sekvenser., Biblioteket består av en 7mer permutable sekvens med en enda dU i mitten (Fig. 5). Permutation av 3-nt flanking regioner, 5′- samt 3′ av dU resulterar i 4096 unika sekvenser. I dubbelsträngat format tillsattes en slinga och den kompletterande sekvensen till 7mer, vilket ledde till bildandet av en hårnålstruktur. Ytterligare dG * dC – baspar i hårnålsstammen bidrog till att öka smälttemperaturen hos hårnålens DNA-struktur. Dessa baspar tillsattes till de enkelsträngade substraten för att hålla ssDNA-och dsDNA-mönstren så lika som möjligt., Slutligen tillsattes en 25mer oligonukleotid till 5 ’ – änden av varje design för att fungera som ett hybridiseringsmål. En representativ figur av sekvensdesignerna visas i Fig. 5.

även om terminal märkning av DNA med ett fluorescerande färgämne är en bekväm metod för att direkt mäta fluorescensintensitet, bär den nackdelen med hög fluorescensbuller som, särskilt på högdensitetsmikroarrayer, gör datautvinning och tolkning svårare. Därför bestämde vi oss för att övervaka klyvningsreaktionen via hybridisering till de immobiliserade sekvenserna., Före behandling med UDG hybridiserades de enkel-och dubbelsträngade DNA-substraten till den märkta kompletterande 25mer-oligonukleotiden och skannades för att erhålla initiala fluorescensvärden. Därefter exponerades mikroarrayerna för UDG under olika tidsperioder. Efter följande ap-plats-klyvning under alkaliska förhållanden hybridiserades arrayerna igen till deras Cy3-märkta komplement. Minskningen av FLUORESCENSSIGNALEN hos DNA-strängarna i förhållande till fluorescensvärden före behandling motsvarar direkt klyvningseffektivitet., Maximal klyvningseffektivitet på cirka 40% erhölls för dubbelsträngade substrat efter UDG-inkubation i 2 minuter och något lägre klyvningshastigheter för enkelsträngade substrat (tabell S1). Denna lägre nivå för enkelsträngade motsäger tidigare studier som tyder på att de klyvs snabbare än deras dubbelsträngade ekvivalenter13,47 och 48. Intressant är att mycket korta enzymakubationer (<1 min) fortfarande leder till betydande klyvningseffektivitet (30-35%)., Dessa korta tidpunkter är särskilt intressanta eftersom de ger tydliga tips om potentiella sekvenspreferenser. För att identifiera sekvensberoende i den UDG-medierade DNA-nedbrytningen från vår uppsättning 4096 enskilda strängar fokuserade vi på 1% (Fig. 6) samt 5% (Fig. S3) av de mest och minst klyvda delmängden sekvenser. Representativa sekvensmotiv som genereras från dessa sekvensundergrupper visas i Fig. 6 och i Tilläggsuppgifterna.,

för dubbelsträngat DNA (Fig. 6A,B), visar resultaten en tydlig UDG sekvens preferens för G/C-rika regioner kompletterande uracil. Omvänt verkar UDG dåligt bearbeta dubbelsträngade substrat som innehåller T * A-baspar. Motiven extraherade från bättre och fattigare UDG-substrat överensstämmer delvis med det mycket begränsade befintliga litteraturdata48, 49, 50. Seibert et al., hypoteser att effektiviteten hos E. coli UDG är relaterad till den energiska kostnaden för DNA-böjning och distorsion som uppstår i processen med specifik skadeigenkänning. I molekyldynamiksimuleringar och tidsupplösta fluorescensexperiment med två uracil-innehållande dubbelsträngade DNA-sekvenser identifierade de att de effektiva böjningskraftskonstanterna är lägre om dAs eller dTs ligger intill uracil-nukleotiden, istället för dGs och dCs; vilket tyder på att DA / dT-rika sekvenser lättare kan böjas av UDG och därmed bättre bearbetad49., Eftersom enkelsträngat DNA är en mycket mer flexibel form av DNA, kan dess snabbare bearbetning som rapporteras i litteraturen bero på den lägre energiska kostnaden för klyvande substrat som i sig är mer flexibla än dsDNA7,47,49,51. Böjning kan dock inte vara en avgörande faktor i UDG-klyvningsspecificitet hos ssDNA, med enzymet som känner igen och klyver alla substrat lika bra, vilket kanske förklarar frånvaron av sekvenskonsensus i dU-innehållande ssDNA., Det var ändå hypoteser att sekvensens kontexteffekter fortfarande sträcker sig till enkelsträngat DNA och faktiskt hade observerats för UDG från herpes simplexvirus typ 152, men är fortfarande oklart för humant eller E. coli UDG. Slupphaug et al. mätt sekvensspecificiteten hos Human UDG i 34 dsDNA-sekvenssammanhang och antydde att dT 3 ’ till dU alltid resulterar i långsam borttagning som gjorde, något discordantly, ett högt GC-innehåll50. Eftedal et al. utvärderade klyvningseffektiviteten hos både kalvtymus och E. coli UDG från 41 dsDNA-sekvenser och fann ett liknande mönster., Med vår mycket större uppsättning sekvenser kan vi instämma i att dT 3 ’till dU alltid resulterar i långsam borttagning, men våra data visar tydligt att dC, och dG i mindre utsträckning, 3’ till dU resulterar i snabb borttagning. Vi kunde inte identifiera betydande sekvensberoende för du excision på ssDNA (Fig. 6C,D). Det bör noteras att sekvensberoende i dsDNA-substrat är tydligt för korta enzymatiska behandlingar (5s, 30s, 60s och 120s), men sakta bleknar bort för längre UDG-exponering (30min), vilket indikerar att alla substrat slutligen klyvs när de utsätts för enzymet.,

optimeringar av Klyvningsställen

eftersom inget signifikant sekvensberoende för UDG-medierad uracil-excision av ENSTRÄNGAT DNA framkom från våra studier och ganska måttliga klyvningseffektivitet för enstaka dU-inkorporationer erhölls, valde vi att studera UDG-medierad du-excision på längre enkelsträngade substrat som innehåller olika former av flera dU-inkorporationer, som syftar till att identifiera specifika klyvningsställen som är lättillgängliga enzymatiskt och möjliggör snabb och effektiv strängklyvning., Vår motivering är att öka avståndet från sonden från ytan bör ge större tillgänglighet för klyvning, men denna effekt får inte överföras till långa distanser (>20-nt)53. Baserat på resultaten från Fig. 3, Vi förväntar oss också att ett högre antal dU-inkorporationer leder till större övergripande klyvning, men vi undrar om det finns en optimal densitet av du-nukleotider inom den klyvbara delen av DNA-strängen. Därför undersökte vi uracil klyvning på längre dU homopolymerer (10, 15 och 20mers) samt på oligomerer med varierande %dU sammansättning., Andelen dU inom oligomeren beräknades i förhållande till de övriga fyra nukleotiderna (dA, dC, dG och dT) och uppnåddes experimentellt genom att utföra kopplingsreaktioner med förblandade lösningar av du/dA/dC/dG / dT fosforamiditer i olika förhållanden (0:100, 12:88, 25:75, 50:50 eller 100: 0, (v/v) dU: dA / dC / dG / dT). De sekvenser, byggd på poly-dT linkers av varierande längd (dT1, dT5, dT10 och dT15), och dU-som innehåller regionen skulle sedan avslutas med en 25mer målsekvenser för hybridisering ändamål som anges i Fig. 7.,

efter syntes hybridiserades 25meren till dess komplementära 5′-Cy3-märkta oligonukleotid och mikroarrayen exponerades för UDG i 1 timme., Därefter utfördes klyvning av den abasiska platsen under alkaliska förhållanden, följt av en slutlig rehybridisering. Parallellt utförde vi också klyvningstestet med ANVÄNDARENZYMET, vilket i detta fall eliminerar behovet av ett ytterligare abasiskt klyvningsprocedur.

för enzymanalysen med UDG följt av klyvning av abasiskt ställe under alkaliska förhållanden (Fig. 7, vänster), vi registrerade klyvningseffektivitet som sträcker sig från 4% upp till 80% och med tydliga trender framväxande., Klyvningseffektiviteten ökar till exempel betydligt med ökande längd på dU-innehållande regionen, i storleksordningen 10mer > 15mer > 20mer, med maximalt ~50% klyvning nås för en 10mer du-region och 80% maximalt för 20mer du-regionen. På samma sätt resulterar längre linkers i en övergripande högre klyvningshastighet. Dessa observationer tyder på att längre sekvenser är bättre erkända och motsvarande uracil-baser bättre utskurna av UDG, vilket i sin tur tyder på en större tillgänglighet av de längre substraten av enzymet., Klyvningseffektiviteten påverkas också av mängden du-nukleotider inom den klyvbara delen av substratet. Uracil homopolymerer (100% dU) är faktiskt nästan alltid mindre klyvda än deras kongener med interspersed du nukleotider, och denna effekt är särskilt tydlig när substraten syntetiseras över en kort T1-linker. Å andra sidan möts ökningen av dU-innehållet från 12 till 50% med ökad klyvningseffektivitet, med 50% dU som verkar vara den optimala mängden., Under våra experimentella förhållanden var UDG-medierad klyvning den mest effektiva på de längsta substraten där hälften av nukleotiderna i den klyvbara delen är dU (80% klyvningseffektivitet). Denna trend, liksom data som visas i Fig. 3, föreslår att UDG kan känna igen och binda till flera Du-inkorporationer, så länge som dUs separeras av kanoniska DNA-nukleotider.

medan korta homopolymerer i allmänhet är kända för att vara dåliga UDG-substrat, förväntade vi oss också att observera låga klyvningshastigheter för de 20mer klyvbara regionerna eftersom sådana substrat sannolikt inte finns i DNA., In vivo uppträder uracil-baser huvudsakligen i DNA-strängar på grund av felaktig inkorporering under replikering eller på grund av deamination8,9 och båda processerna är osannolikt att inträffa vid en så hög frekvens för att bilda homopolymerer. Icke desto mindre erhölls måttliga till höga klyvningseffektivitet på omkring 60% på Long 20mer du homopolymerer, men huruvida dessa homopolymerer behandlas långsammare än substrat med lägre %dU-innehåll återstår att undersöka.

behandla ett liknande DNA-array-bibliotek med användar enzymsystemet (Fig., 7, höger) leder till tillfredsställande klyvning av enkelsträngade substrat, med klyvningstrender som är något jämförbara med UDG-fallet men med några anmärkningsvärda undantag. För det första är den högsta klyvningseffektiviteten lägre än för UDG/Eda-systemet (55% respektive 80%), vilket kan hänföras till en långsammare bearbetning av de abasiska platserna med Endonukleas VIII jämfört med en vanlig grundbehandling med EDA., För det andra verkar det finnas en svagare längddiskriminering i den klyvbara regionen jämfört med UDG/EDA, med endast 20-25% skillnad högst mellan korta (10-nt) och långa (20-nt) dU-innehållande regioner, när UDG ensam behandling ledde till stora variationer i klyvningseffektiviteten hos samma 10 och 20mers (upp till 50% skillnad). Återigen kan denna effekt bero på skillnader i bearbetningshastigheten för AP-webbplatser. Slutligen verkar du homopolymerer brytas ned i samma utsträckning, oavsett linker-eller substratlängd., Denna brist på diskriminering i ANVÄNDARENZYMFALLET och jämfört med UDG-medierade klyvningsdata tyder på att förekomsten av flera på varandra följande AP-platser är den begränsande faktorn vid enzymatisk borttagning av AP-platser.

Sammanfattningsvis fann vi i våra händer att de bästa klyvningseffektiviteten kan uppnås med UDG-medierad klyvning följt av EDA-behandling på längre, icke-homopolymeriska uracilhaltiga substrat. På så sätt kan enkelsträngade sekvenser som innehåller 50% dU klyvas effektivt, om än i två steg., En kort, enkelstegsbehandling med användar enzymcocktailen kan också bekvämt klyva upp till 50% av dU-innehållande enstaka strängar på en timme, men den uppenbarligen lägre diskriminerande kraften i denna speciella enzymatiska behandling kan vara mindre användbar när en förmånlig klyvning krävs.