Vad är flödescytometri (FACS-analys)?

ursprungligen utvecklades i slutet av 1960-talet, flödescytometri är en populär analytisk cellbiologi teknik som använder ljus för att räkna och profilera celler i en heterogen vätskeblandning. Flödescytometri är en särskilt kraftfull metod eftersom den tillåter en forskare att snabbt, noggrant och helt enkelt samla in data relaterade till många parametrar från en heterogen vätskeblandning som innehåller levande celler.,

flödescytometri används i stor utsträckning under hela livet och biomedicinska vetenskaper, och kan tillämpas i vilket scenario som helst där en forskare snabbt behöver profilera en stor population av lösa celler i ett flytande media. Till exempel, i immunologi flöde cytometri används för att identifiera, separera och karakterisera olika immunceller subtyper på grund av deras storlek och morfologi.

När ytterligare information krävs, antikroppar märkta med fluorescerande färgämnen, och upphöjda mot mycket specifika cellytantigener (t .ex., kluster av differentiering eller CD-markörer) kan användas för att bättre identifiera och segregera specifika delpopulationer inom en större grupp.

i en flödescytometer

• provceller passerar genom en smal kanal en åt gången.
• ljus används för att belysa cellerna i kanalen.
• en serie sensorer detekterar de typer av ljus som bryts eller avges från cellerna.
• data som erhållits av sensorerna sammanställs och integreras för att bygga en omfattande bild av provet.,

FACS-antikroppar som För närvarande används för forskning

olika typer av ljus som används i ett flödescytometri experiment

en flödescytometer använder brytas eller emitterat ljus för att räkna och identifiera celler. Läs om olika typer av ljus som används i ett flödescytometri experiment i följande figurer.,

framåt Scatter

framåt spritt ljus bryts av en cell i flödeskanalen och fortsätter längs i ljusvägen (dvs. samma riktning som ljuset ursprungligen färdades). Framspridda ljus detekteras av en sensor i ljusvägen, och används vanligtvis för att identifiera partikelstorlek.

framåtriktat ljus används oftast för att upptäcka objektets storlek i ljusvägen., Större objekt kommer att producera mer framåtriktat ljus än mindre objekt, och större celler kommer att ha en starkare framåtspridningssignal

Sidospridning

sidospridda ljus passerar från belysningskällan till flödeskanalen, bryts av celler i en riktning som ligger utanför den ursprungliga bilden.ljus väg. Sidospridda ljus detekteras av en sensor som är ortogonal till den ursprungliga ljusvägen.,

sidospridda ljus används vanligtvis för att bestämma cellens granularitet och komplexitet i ljusvägen. Mycket granulära celler med en stor mängd intern komplexitet, som neutrofiler, kommer att producera mer sidospridda ljus och en högre sidospridningssignal än celler med låg granularitet och komplexitet.

Fluorescensutsläpp

fluorescerande ljus avges av fluorescerande molekyler efter excitation med en kompatibel våglängdslaser., Fluorescerande ljus kan härröra från naturligt fluorescerande material i cellen, eller kan härröra från fluorescerande färgämnen eller fluorescensmärkta antikroppar som har använts för att märka en specifik struktur på cellen.

Multiparametrisk analys

en mock flow cytometry dot-plotting framåt vs sida-utspridda från en population av leukocyter., Cellpopulationer är markerade med deras sannolika identitet:

d förmodade skräp, mycket små föremål med låg låg fram – och sidospridning.

L/M sannolika leukocyter/monocyter, små till medelstora celler med låg inre komplexitet / granularitet. Dessa celler genererar en medel framåt-scatter och låg sida-scatter signalintensitet

g sannolika granulocyter, stora celler med hög inre komplexitet/granularitet. Dessa celler genererar höga fram – och sidospridningssignaler.,

medan vissa identiteter kan bekräftas av fram-och sidospridningsprofiler, ger märkning med en celltypsspecifik markör alltid större upplösning och säkerhet vid profilering av komplexa heterogena populationer av celler.

till exempel i tomten ovan kan en forskare kunna skilja mellan granulocyter och lymfocyter med hjälp av fram-och sidospridda ljus. Tre klasser av granulocyter (neutrofiler, basofiler och eosinofiler) är emellertid mycket lika i storlek och struktur, vilket ger dem liknande ljusspridningsegenskaper., I detta fall kan neutrofiler selektivt märkas på grund av deras uttryck en specifik markör för neutrofila granulocyter som Elane.

FACS: sortering av celler baserat på Flödescytometridata

termerna flödescytometri och fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) används ofta omväxlande. I praktiken finns det skillnader mellan de två metoderna.

FACS är ett derivat av flödescytometri som ger en exceptionell grad av funktionalitet. Med hjälp av FACS kan en forskare fysiskt Sortera en heterogen blandning av celler i olika populationer.,

genom att använda mycket specifika antikroppar märkta med fluorescerande färgämnen kan en forskare utföra FACS-analys och samtidigt samla in data på och sortera ett prov med ett nästan obegränsat antal olika parametrar.

i ett FACS-Experiment:

• framåt-scatter, sida-scatter och fluorescerande data samlas in, som i konventionell flödescytometri.
• användardefinierade parametrar ger information om hur celler ska sorteras.
• baserat på dessa parametrar använder FACS-maskinen en elektrod för att införa en elektrisk laddning på varje cell.,
• när du lämnar flödeskammaren sorterar elektromagneter celler genom laddning i separata kärl.

hur ser Flödescytometridata ut?

i ett flödescytometriexperiment klassificeras varje cell som passerar genom flödescytometern och detekteras som en distinkt händelse.

dessutom kommer varje typ av ljus som detekteras av flödescytometern (framåtspridning, sidospridning och varje våglängd för fluorescensutsläpp) att tilldelas sin egen unika kanal., Flödescytometri data kommer att plotta varje händelse oberoende, och kommer att representera signalintensiteten av ljus som detekteras i varje kanal för varje händelse.

Flödescytometridata representeras vanligtvis på ett av två sätt: histogram, som mäter eller jämför endast en enda parameter och dot-tomter som jämför 2 eller 3 parametrar samtidigt på en två – eller tredimensionell scatter-plot.

ett histogram visar typiskt intensiteten som detekteras i en enda kanal längs en axel och antalet händelser som upptäcks vid den intensiteten är i en separat axel., Ett stort antal händelser som upptäcks vid en viss intensitet visas som en spik på histogrammet.

i en punktplot representeras varje händelse som en enda punkt på en scatter-plot. Intensitet av 2 olika kanaler (eller 3 olika kanaler i en tredimensionell tomt) representeras längs de olika axlarna. Händelser med liknande intensiteter kommer att klustera ihop i samma region på scatter-plottet.

histogram och dot-plottar ger båda olika fördelar för flödescytometridataanalys. Att välja hur du bäst kan representera dina data kan bidra till att den berättar en komplett historia i ett enkelt, begripligt format.

Dot-tomter och histogram är inte ömsesidigt exklusiva, och de flesta komplexa flödescytometri experiment kommer att använda sig av flera tomter för att visa rika, multiparametriska data på ett prov.

i många fall måste mer än tre parametrar ritas samtidigt., I det här fallet kan en dataanalysteknik som kallas gating bidra till att ge ytterligare upplösning och flexibilitet, vilket möjliggör analys av en nästan obegränsad mängd parametrar samtidigt över flera olika scatter-tomter och histogram.

Gating lägger till upplösning för Flödescytometridata

kort sagt är gating en metod för att välja celler från ett flödescytometriexperiment som du vill analysera mer specifikt., Gating tillåter en forskare att samla in och visa mer information om en subpopulation av celler än vad som normalt kan visas på en 2 – eller 3-dimensionell dot-plot.

Gating lägger upplösning till ett flödescytometri experiment, och möjliggör samtidig analys av ett nästan obegränsat antal olika parametrar (kanaler).

i ett experiment med gated Flow Cytometry:

• en användare samlar in flödescytometridata från en eller flera kanaler på en punktplot.
• baserat på de data som förvärvats ritar användaren en gatebox som väljer en subpopulation av celler för vidare analys.,
• subpopulationen av celler i porten kommer att markeras specifikt på andra tomter som visar information från alternativa kanaler.

Gates lägger till en otrolig mängd flexibilitet för flödescytometri, vilket ger upp till encellsupplösning för varje kanal som är tillgänglig för forskaren. Flera portar kan etableras för en enda scatter-plot, och grindar kan” staplas ” och kombineras (dvs en subpopulation av celler gated för i kanaler 1 och 2 kan ytterligare gated för kanaler 3 och 4 för att möjliggöra mer specificitet och djupare analys).,

ett exempel på parning

en anteckning om ersättning

Spillover från en kanal till en annan kan orsaka falskt som positiva identifierade signaler. Spillover är den artefaktuella signalen som ett fluorescerande färgämne kan orsaka i kanalen av en annan fluorophore som en funktion av dess relativa ljusstyrka och emissionsspektrum. Det är här ersättning kommer in i bilden. Kompensation är ett förfarande som isolerar signalen från en viss kanal från de andra kanalerna som används i samma experiment. FITC exempel, har sin utsläppstopp i det gröna området av det elektromagnetiska spektrumet. Det gör dock också fluoresce i den gula kanalen där PE avger ljus. Enkelt uttryckt subtraherar kompensationen FITC-signalen från PE-kanalen.

denna signal i ”fel” kanal subtraheras från signalen som orsakas av fluoroforen av intresse. I ovanstående prov är förhållandet mellan den gröna och den gula komponenten vid en given exciteringsvåglängd konstant för FITC., Det är således möjligt att dra slutsatsen mängden ospecifik gul FITC-signal i PE-kanalen från mätningen i den gröna kanalen med hjälp av de konstanta kompensationskoefficienterna. Detsamma gäller för spillover från PE till FITC-kanalen.